《Frontiers in Microbiology》：Metagenomic next-generation sequencing improves pathogen detection in culture-negative infections: a diagnostic performance study
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常规微生物学诊断常常敏感性不足、耗时长且具有靶向性。存在基础免疫抑制以及近期接受过抗生素治疗的患者，其感染往往呈培养阴性。近年来，宏基因组二代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）已发展成为
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常规微生物学诊断常常敏感性不足、耗时长且具有靶向性。存在基础免疫抑制以及近期接受过抗生素治疗的患者，其感染往往呈培养阴性。近年来，宏基因组二代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）已发展成为一种新型的、不依赖病原体预设的（pathogen-agnostic）诊断方法。本研究于2022年8月至2024年1月期间，共收集136份临床标本送检mNGS。其中，来自73例患者的86份标本被纳入这项回顾性研究，13例患者有不止一份标本被纳入研究。所有标本均采用常规微生物学方法处理，并采用mNGS技术进行分析，分别使用Illumina二代测序技术或Oxford Nanopore长读长测序技术。研究人员计算了两种方法的诊断性能指标，包括敏感性、特异性、阳性预测值（positive predictive value，PPV）和阴性预测值（negative predictive value，NPV）。采用Cohen's kappa系数评估两种方法之间的一致性，并采用McNemar检验进行配对比较。研究人员计算了两种方法的受试者工作特征曲线下面积（area under the ROC curve，AUC），并采用多变量logistic回归分析确定与mNGS阳性独立相关的变量。结果显示，常规微生物学在16.3%的标本中鉴定出病原体，而mNGS在45.3%的标本中鉴定出病原体。mNGS的敏感性和特异性分别为57.1%和84.2%。McNemar检验显示mNGS对病原体的检出具有显著性差异（p = 0.0015）。两种方法之间的一致性较差（kappa = 0.20）。mNGS结果的ROC曲线显示中等诊断准确度，AUC为0.71。多变量logistic回归分析显示，免疫抑制状态（OR 2.8，95% CI 1.3–6.0，p = 0.018）和阳性影像学发现（OR 3.1，95% CI 1.4–6.9，p = 0.010）与mNGS阳性独立相关。mNGS能够在培养阴性病例中比常规方法鉴定出更多病原体。mNGS有望以互补的方式使用，同时依赖常规方法作为感染诊断的主要工具。值得注意的是，mNGS在免疫抑制患者中提供的额外信息价值最大。
论文解读
一、研究背景与意义
感染性疾病的准确诊断一直是临床微生物学面临的重大挑战。常规微生物学诊断主要依赖培养-based方法、显微镜检查、抗原检测和靶向分子检测，这些方法均受限于敏感性不足、周转时间长以及对致病病原体的先验假设依赖。培养-based诊断常常无法鉴定致病微生物，尤其是在接受过前期抗菌治疗、存在深部或侵袭性感染、或感染苛养菌、慢生长菌或难以培养微生物的患者中。多项研究报道，超过半数疑似感染患者的培养结果呈阴性或非诊断性。真菌感染的诊断局限性尤为突出，培养和组织病理学作为参考标准，常因敏感性低、生长延迟、难以获取足够组织样本以及物种水平鉴定困难而受到制约。
宏基因组二代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）作为一种不依赖病原体预设的诊断方法，能够直接从临床标本中同时检测细菌、病毒、真菌和寄生虫，无需对致病病原体做出先验假设。与依赖微生物活性或靶向检测的常规方法不同，mNGS可以识别苛养菌、不可培养菌或意外病原体，将诊断谱扩展到常规方法之外。然而，mNGS并非旨在取代常规微生物学，而是作为补充诊断手段，特别是在标准检测阴性、不确定或受前期抗菌药物暴露或标本类型限制的情况下。
既往比较mNGS与常规微生物学方法的研究持续显示两种方法之间的不完全一致性，反映了诊断原理和分析敏感性方面的根本差异。不一致结果最常见于常规培养阴性但mNGS鉴定出潜在病原体的情况，这种模式常与前期抗菌药物暴露、多微生物感染、罕见或苛养微生物以及组织-based标本相关。反之，常规微生物学阳性但mNGS未能检测到相同微生物的情况也有报道，凸显了低病原体载量、核酸降解以及测序深度或生物信息学阈值变异等因素的影响。
本研究填补的研究空白在于：常规分子和血清学方法在微生物实验室中受限于“一种病原体、一种检测”的范式，在检测低浓度微生物方面效率低下，且缺乏多重检测能力。感染诊断模型需要更全面的诊断工具来克服这些局限性，提高病原体识别的准确性和速度。研究假设为：mNGS可以显著增强临床样本中病原体的检测和表征，包括常规方法未能诊断的病原体，从而提供更准确、更快速的诊断，改善患者治疗结局。本研究的主要目标是在传染病mNGS-based诊断方面建立本地能力，通过建立高效的研究方案，使mNGS与当前最先进的临床微生物实验室检测并行运行，以识别潜在病原体或逃逸常规检测的病原体。
二、研究设计与关键技术方法
研究人员开展了一项针对三级医院的回顾性观察性分析研究。研究纳入2022年8月至2024年1月期间疑似感染但常规实验室检测未获得阳性结果的患者。标本类型根据疑似感染部位确定：败血症取血液，脑炎取脑脊液，肺炎取肺部样本。所有标本首先送微生物实验室进行常规检测，同时将同一标本的一部分送遗传学部门进行mNGS分析，实现两种方法的平行检测。共136份标本被评估纳入，最终86份来自73例患者的标本纳入分析，其中13例患者贡献了不止一份标本。患者中位年龄45岁，70.9%为男性。标本以液体样本为主（65.1%），其次为活检或组织样本（30.2%）和手术伤口培养样本（4.7%）。队列中免疫抑制患者比例较高：恶性肿瘤23.3%，实体器官或骨髓移植40.7%，接受免疫抑制治疗58.1%，采样时接受抗菌治疗86.0%，阳性影像学发现80.2%。
关键技术方法包括：DNA提取使用Qiagen试剂盒，RNA分离使用Qiagen RNASE FFPE试剂盒，cDNA合成使用GoScript?逆转录酶和第二链合成试剂盒。核酸纯度和浓度分别通过NanoDrop分光光度法和Qubit? dsDNA高灵敏度检测试剂盒评估，片段大小分布使用Agilent 2100 Bioanalyzer评估。为去除宿主DNA，使用稀释的Saponin在60°C、700–800 rpm条件下涡旋30分钟。研究比较了两个主流mNGS平台——Illumina MiSeq和Oxford Nanopore Technologies（ONT）GridION Mk1——的差异。文库制备分别使用Illumina DNA Prep试剂盒和Native Barcoding Kit（SQK-NBD114.24）。测序数据分析使用EPI2ME、PFI + MGAP和CosmoID-HUB等多个生物信息学管道，通过整合读长数、相对丰度、基因组覆盖度、分类学鉴定置信度、标本类型、阴性对照和临床鉴定合理性等多参数进行病原体判定。mNGS周转时间一般为24至72小时。
三、研究结果
研究人群和样本特征：86份标本来自73例患者，中位年龄45岁，70.9%为男性。液体样本56份（65.1%），活检或组织样本26份（30.2%），手术伤口培养样本4份（4.7%）。恶性肿瘤20例（23.3%），移植35例（40.7%），免疫抑制治疗50例（58.1%），采样时抗菌治疗74例（86.0%），阳性影像学发现69例（80.2%）。
mNGS与常规微生物学的诊断性能比较：以常规微生物学为参考标准，mNGS的敏感性为57.1%（8/14；95% CI：~28.9–82.3%），特异性为84.2%（32/38；95% CI：~68.7–94.0%），PPV为24.2%（95% CI：~11.1–41.2%），NPV为84.2%（95% CI：~68.7–94.0%）。
宏基因组测序诊断产出：mNGS在86份样本中的39份（45.3%）鉴定出至少一种病原体，47份（54.7%）未检出微生物。细菌病原体26例（30.2%），真菌、病毒或其他非细菌病原体9例（10.5%），多微生物共感染4例（4.7%）。
按样本类型分层诊断产出：活检/组织样本（n = 26）中mNGS阳性12例（46.2%），液体样本（n = 56）中阳性25例（44.6%），手术伤口培养样本（n = 4）中阳性2例（50.0%）。
无菌部位与非无菌部位病原体分布：无菌部位样本39份中mNGS阳性19例（48.7%），非无菌部位样本47份中阳性20例（42.6%）。
一致性与不一致性分析：在14份常规微生物学阳性样本中，mNGS鉴定出相同病原体8例（57.1%），不同病原体3例（21.4%），未检出病原体3例（21.4%）。总体病原体水平一致性为57.1%，不一致性为42.9%。在8例一致病例中，3例（37.5%）mNGS检出额外微生物，属于部分一致。在57份培养阴性样本中，mNGS在25例（43.9%）中鉴定出病原体，其中细菌占56.0%（14/25），真菌占24.0%（6/25），病毒占12.0%（3/25），多微生物检出占8.0%（2/25）。最常见的病原体包括铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，n = 4）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，n = 3）和烟曲霉（Aspergillus fumigatus，n = 2）。
配对比较：64例配对比较中，25例mNGS检出常规方法未鉴定的病原体，6例常规微生物学检出mNGS未发现的病原体。McNemar检验χ2 = 10.03，p = 0.0015，确认两种方法诊断能力存在显著差异，mNGS效率更高。
方法间一致性：Cohen's kappa系数为0.20，观察一致性约56.3%，预期一致性45.0%，表明两种方法之间一致性较差，源于两者根本的方法学差异。
ROC分析：mNGS的AUC为0.71，显示中等诊断准确度，与mNGS的高NPV一致，提示该方法可作为疑似感染患者的排除性检测工具。
多变量分析：免疫抑制状态（OR 2.8；95% CI 1.2–6.3；p = 0.018）和阳性影像学发现（OR 3.1；95% CI 1.4–6.7；p = 0.010）是mNGS阳性的独立预测因子。
平台和生物信息学性能：23份同时使用ONT和Illumina平台测序的样本中，62.5%（14/23）结果一致，ONT额外检出31%（7/23），Illumina额外检出6.5%（1/23）。ONT周转更快（24–36小时 vs. Illumina的36–72小时），核酸浓度≥4 ng/μL时结果可靠，而Illumina在<4 ng/μL时表现更优。脑脊液（59%，17/29）和支气管肺泡灌洗液（66.6%，10/15）的阳性率高于血液（27.7%，5/18）和组织（28.5%，2/7）。Saponin宿主去除可增加微生物读长数。
四、讨论与结论
讨论部分指出，本队列中66.3%的样本培养阴性，表明在危重患者疑似感染的诊断中存在显著诊断缺口。深部感染、前期抗菌药物暴露和经验性治疗均可能导致高培养阴性率。mNGS在培养阴性病例中提供了43.9%的诊断率，提供了统计学上显著的额外诊断信息（McNemar检验p = 0.0015）。两种方法间一致性较差（kappa = 0.20），这源于培养和mNGS是根本不同的感染诊断方法，各有对方无法填补的局限性。mNGS可以识别非存活微生物、低丰度微生物和多微生物感染，而培养在采样前接受过抗生素治疗的患者中局限性尤为突出。ROC分析显示mNGS具有中等区分能力（AUC = 0.71），高NPV使其成为优秀的排除性检测工具。免疫抑制和阳性影像学发现是mNGS阳性的独立预测因子，提示mNGS的最高诊断产出将在高感染先验概率患者中获得。低PPV（24.2%）提示解读不一致结果时需谨慎，培养阴性/mNGS阳性样本不应一律视为假阳性，而应结合临床症状、影像学发现、免疫状态、样本来源、既往抗生素使用和生物学合理性综合判断。无菌部位检出、已知病原体高丰度检出以及非无菌部位低丰度检出更可能代表真实感染。
研究结论：在临床挑战性队列中，mNGS的诊断产出显著高于常规微生物学方法，尤其在培养阴性病例和免疫抑制患者中。两种方法在病原体检测的统计学比较中仅显示有限一致性，源于其诊断原理的根本差异。临床样本的宏基因组二代测序在疑似感染患者病原体鉴定中显示中等诊断准确度，在临床高度疑似患者中诊断准确度最高，尤其是免疫抑制患者和具有支持性影像学发现的病例。数据支持mNGS作为与常规微生物学方法联合使用的补充诊断工具。未来需要开展前瞻性研究，阐明mNGS驱动的诊断及其对临床结局、治疗成本和整体管理的意义。
