SYNJ2BP与实验模型中线粒体异常及骨骼肌萎缩的关联研究

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：SYNJ2BP is associated with mitochondrial abnormalities and skeletal muscle atrophy in experimental models

　　

专业摘要翻译：骨骼肌萎缩与线粒体功能障碍相关，但突触蛋白2结合蛋白（SYNJ2BP）在此过程中的作用尚不明确。研究人员对人冈上肌的蛋白质组学分析发现，萎缩组织中SYNJ2BP丰度升高，同时伴随线粒体及钙相关蛋白组的改变。小鼠肌腱横断术后冈上肌中亦观察到SYNJ2BP丰度升高。在C2C12细胞中，SYNJ2BP过表达伴随肌源性及萎缩相关蛋白改变、线粒体超微结构异常、三磷酸腺苷（ATP）含量降低及Rhod-2荧光增强。VBIT-4可减弱其中若干变化，但同时降低SYNJ2BP丰度，限制了其作为选择性下游挽救措施的解读。研究人员在电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）免疫沉淀物中回收了SYNJ2BP、肌醇1,4,5-三磷酸受体1（IP3R1）及葡萄糖调节蛋白75（GRP75）。VDAC1诱饵回收增加及输入丰度差异排除了将更高的蛋白回收解读为更强相对结合的可能性。在另一独立的小鼠后肢固定模型中，局部SYNJ2BP敲低与线粒体形态保持、肌肉萎缩减轻及运动表现改善相关。上述互补性观察提示SYNJ2BP参与肌肉萎缩，并推动对IP3R1/GRP75/VDAC1相关钙调控的进一步研究，但尚不能确立跨模型共享的因果机制。含绿色荧光蛋白（GFP）的表达载体亦要求对活性氧及膜电位测量进行独立验证。后续工作应确立生理性表达相关性、细胞分化状态及钙转移的方向与特异性。

论文解读：

一、研究背景与科学问题

骨骼肌是维持机体运动、能量代谢及全身蛋白质稳态的重要组织。当蛋白质降解速率超过合成速率时，即发生肌肉萎缩，表现为肌肉质量及肌纤维横截面积下降，常伴随肌力减弱和运动能力受损。长期卧床、失神经支配、肌腱损伤等失用状态均可诱发肌肉萎缩，而增龄相关的肌肉丢失则与肌少症密切相关。肌肉萎缩的病理机制涉及蛋白质代谢失衡、炎症反应、再生障碍及线粒体功能障碍等多个层面。线粒体通过氧化磷酸化产生ATP，并参与钙信号转导、氧化还原调控及细胞死亡通路。在骨骼肌中，线粒体功能对能量需求的动态适应尤为关键；线粒体功能障碍可损害ATP供应、增加氧化应激并扰乱调控肌肉蛋白质转换的信号通路。然而，连接线粒体功能障碍与特定类型肌肉萎缩的上游调控因子仍未被充分阐明。

钙离子作为细胞内信使，在骨骼肌中耦联兴奋-收缩过程，并协调线粒体代谢与细胞能量需求。生理性钙摄取支持线粒体功能，而过度积累则可破坏生物能量学并促进氧化应激与细胞损伤。内质网（ER）与线粒体接触位点的钙交换涉及由IP3R1、GRP75及VDAC1组成的蛋白复合物：IP3R1介导ER钙释放，GRP75耦联IP3R1与VDAC1，VDAC1则允许钙穿越线粒体外膜。在非肌肉系统中，该机制的紊乱与线粒体钙失衡、氧化损伤及细胞凋亡相关，但其调控是否参与骨骼肌萎缩尚待研究。

SYNJ2BP是一种线粒体外膜蛋白，参与蛋白招募及ER-线粒体接触调控。其与骨骼肌萎缩的关系此前尚不明确。基于此，研究人员利用人冈上肌组织进行发现性蛋白质组学分析，并通过小鼠冈上肌肌腱横断模型验证肌腱损伤后的表达变化，另以独立的后肢固定模型检验局部SYNJ2BP操作对失用性萎缩的影响，旨在评估SYNJ2BP在上述不同情境中的相关性。

二、研究设计与主要结论

研究人员发现，萎缩的人冈上肌组织中SYNJ2BP丰度显著升高，并伴随线粒体组织、呼吸链及氧化磷酸化相关蛋白组下调，以及钙离子结合基因集的富集。在C2C12细胞中，SYNJ2BP过表达与肌源性标志物下调、萎缩相关蛋白上调、线粒体超微结构异常、ATP含量降低及Rhod-2钙相关荧光增强相关联。在VDAC1免疫沉淀物中可回收SYNJ2BP、IP3R1及GRP75。在独立的小鼠后肢固定模型中，局部SYNJ2BP敲低与线粒体形态保持、肌肉萎缩减轻、肌力及运动耐力改善相关。上述结果共同提示SYNJ2BP参与骨骼肌萎缩过程，但尚不能确立跨模型的统一因果机制。

三、主要技术方法

本研究综合运用多种技术手段：人冈上肌样本来自苏北人民医院关节镜手术患者，依据术前MRI分为对照组与萎缩组，每组3例，样本冻存后送商业机构进行蛋白质组学分析；小鼠实验经扬州大学实验动物福利与伦理委员会批准，采用C57BL/6J小鼠建立冈上肌肌腱横断模型（12只）及后肢固定模型（24只，分4组，每组6只），通过腺相关病毒（AAV）载体实现SYNJ2BP过表达或敲低的局部递送；细胞实验采用C2C12小鼠成肌细胞，以慢病毒载体建立SYNJ2BP过表达体系；主要检测手段包括蛋白质印迹、免疫共沉淀、透射电子显微镜、荧光探针检测（DCFH-DA检测活性氧、JC-1检测线粒体膜电位、Rhod-2 AM检测钙相关荧光）、ATP含量测定、组织学染色及免疫组化/免疫荧光，另以GRAMM进行蛋白对接预测并用PDBePISA评估界面能量，通过抓力测定及跑台实验评估小鼠肌肉功能与运动表现。

四、研究结果

1. 1.
   冈上肌肌腱损伤与人和小鼠肌肉萎缩相关：术前MRI显示萎缩组患者冈上肌面积与窝面积比值降低；小鼠肌腱横断后肌肉体积减小，H&E染色示肌纤维直径显著低于对照侧，证实萎缩模型成功建立。
2. 2.
   萎缩冈上肌中SYNJ2BP丰度升高：蛋白质组学分析鉴定出萎缩组SYNJ2BP丰度升高，免疫组化及蛋白质印迹在人和小鼠萎缩组织中均确认SYNJ2BP表达增加，同时伴随MYOD、MYOG及MYHC表达下降。
3. 3.
   蛋白质组学变化提示线粒体过程及钙结合改变：GO分析显示萎缩人肌肉中线粒体组织、呼吸及氧化磷酸化相关蛋白组下调；GSEA显示钙离子结合基因集正向富集；蛋白质印迹证实人和小鼠萎缩冈上肌中IP3R1、GRP75及VDAC1丰度均升高。
4. 4.
   VBIT-4减弱SYNJ2BP相关的肌源性及萎缩标志物改变：SYNJ2BP过表达伴随MYOD、MYOG、MYHC下调及Atrogin-1、MuRF-1上调；VBIT-4部分逆转上述变化，但同时降低SYNJ2BP本身丰度及IP3R1、GRP75、VDAC1水平，提示药物效应可能涉及SYNJ2BP丰度改变而非单纯VDAC1抑制。
5. 5.
   SYNJ2BP过表达与线粒体异常相关：透射电镜显示过表达组线粒体嵴断裂、空泡化、线粒体轮廓增大且数量减少；JC-1及DCFH-DA荧光信号改变受载体编码GFP干扰，不能独立确立膜电位下降及ROS升高；ATP含量在过表达组降低，VBIT-4处理后回升；NDUFAB1、PDHA1、MFN2、DRP1丰度下降，总细胞色素c及cleaved caspase-3升高。
6. 6.
   SYNJ2BP过表达增加钙相关Rhod-2荧光：流式细胞术及荧光显微镜均显示过表达组Rhod-2荧光高于对照组，VBIT-4处理降低该信号，提示钙相关荧光改变，但不能独立确立线粒体钙超载或钙转移方向。
7. 7.
   SYNJ2BP与VDAC1在免疫共沉淀中被共同回收：蛋白对接预测SYNJ2BP-VDAC1界面ΔiG为?7.9 kcal/mol；荧光显微镜显示SYNJ2BP及VDAC1信号与线粒体染色重叠；VDAC1免疫沉淀中SYNJ2BP、IP3R1、GRP75均可回收，但GRP75相对VDAC1的回收比值接近对照值，且未校正输入丰度，不能确立增强的复合物组装或结合亲和力。
8. 8.
   SYNJ2BP敲低保持萎缩肌肉线粒体形态：后肢固定模型中，过表达组线粒体肿胀加剧、嵴破坏更重、线粒体轮廓数更少；敲低组线粒体嵴保存较好、轮廓数多于单纯萎缩组，且NDUFAB1、PDHA1、MFN2、DRP1丰度较高，总细胞色素c及cleaved caspase-3较低。
9. 9.
   SYNJ2BP敲低减轻固定诱导的肌肉萎缩：大体观察及H&E染色显示过表达加剧固定相关的肌纤维直径减小，敲低则减轻萎缩；蛋白质印迹显示过表达组MYOD、MYOG、MYHC进一步降低而Atrogin-1、MuRF-1升高，敲低组呈相反模式。
10. 10.
    SYNJ2BP敲低改善肌肉质量与运动表现：萎缩组及过表达组体重、腓肠肌和胫骨前肌质量、抓力、最大跑台时间及距离均低于对照组；敲低组上述指标均优于单纯萎缩组，与形态学结果一致。

五、讨论与结论

讨论部分指出，本研究将SYNJ2BP确立为骨骼肌萎缩的候选调控因子，并提出了涉及SYNJ2BP、线粒体异常及IP3R1/GRP75/VDAC1相关钙调控的工作假说。然而，三种蛋白丰度升高并不等同于钙转运增强，免疫共沉淀回收增加受诱饵回收及输入丰度影响，Rhod-2荧光亦不能直接测量ER至线粒体的钙通量。既往文献显示SYNJ2BP功能具有组织及表达水平依赖性：过表达可增加线粒体与粗面ER接触，运动神经元中SYNJ2BP升高与线粒体氧化功能受损相关，而髓核细胞中SYNJ2BP则具有保护作用。VBIT-4作为VDAC1相互作用化合物，在本研究中同时降低SYNJ2BP丰度，故其效应不能完全归因于VDAC1抑制。肌腱横断与后肢固定模型在解剖部位、年龄、炎症及机械负荷方面存在差异，且AAV实验以生理盐水为对照，缺乏空载体及非靶向shRNA对照，不能完全排除载体相关效应。研究局限性包括人蛋白质组学队列样本量小、GFP干扰荧光检测、Rhod-2探针敏感性、免疫共沉淀受输入丰度影响及超生理表达可能引起非特异性细胞应激等。

结论部分指出，综合观察将SYNJ2BP与线粒体异常及骨骼肌萎缩联系起来。萎缩冈上肌中SYNJ2BP丰度升高，其操作与线粒体形态、肌肉相关标志物及功能结局的改变相关。钙相关荧光及免疫共沉淀结果推动了对IP3R1/GRP75/VDAC1相关调控的进一步研究，但尚不能确立增强的复合物组装或完整因果通路。局部SYNJ2BP降低可能有助于保持肌肉结构与功能，其生理学意义及钙信号机制有待深入研究。