膀胱尿路上皮癌炎症与调节性细胞死亡相关转录组特征：跨队列可重复性、探索性单细胞定位及体外qRT-PCR验证

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Inflammation- and regulated-cell-death–relevant transcriptomic signatures in bladder urothelial carcinoma: cross-cohort reproducibility, exploratory single-cell localization, and in vitro qRT-PCR validation

　　

背景：膀胱尿路上皮癌发生于免疫活跃、代谢应激及组织重塑的微环境中，在该微环境中，调节性细胞死亡（regulated cell death, RCD）通路可能与炎症信号（inflammatory signaling）相互作用。研究人员评估了肿瘤相关转录改变是否可在独立队列间重现，以及所选候选基因能否在单细胞分辨率下定位并获得体外表达验证支持。方法：对TCGA-BLCA（412例原发肿瘤和19例实体组织正常样本）与GSE13507（165例原发肿瘤和9例正常膀胱黏膜对照）分别进行差异表达分析。将在TCGA中得到的15个基因的肿瘤上调转录特征在GSE13507中评估，不进行基因重选。对GSE293189中3例患者的5个纯尿路上皮癌（pure-urothelial-carcinoma, Pure-UC）肿瘤区域进行探索性单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）分析。进一步在SV-HUC-1、T24、5637和UM-UC-3细胞系中通过定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse-transcription PCR, qRT-PCR）评估ULBP1、IL37、COL10A1、COL11A1和IGF2BP3。结果：在16,759个匹配基因中，队列特异性效应呈正相关（Spearman ρ = 0.58，P < 1 × 10^?300），4,102个基因在两个队列中均显著且方向一致。TCGA来源的特征在肿瘤中高于正常组织，并随所报道的病理分期变化，但高度不平衡的分期分布使其不能解释为临床分期分类器。单细胞分析保留1,512个细胞，解析出上皮/肿瘤相关、髓系、T细胞、B细胞、NK细胞（natural killer cell, NK cell）和成纤维细胞区室，并具有不同的基底型、管腔型、上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）和免疫状态。所有5个qRT-PCR候选基因在膀胱癌细胞系中相对于SV-HUC-1均持续上调。结论：该研究识别出一个跨队列可重现的肿瘤相关转录信号，并将所选候选基因置于异质性细胞背景中。qRT-PCR为所选候选基因提供正交的表达水平支持，但转录组或qRT-PCR数据本身均不能确立凋亡（apoptosis）、坏死性凋亡（necroptosis）、焦亡（pyroptosis）或铁死亡（ferroptosis）的功能性执行。

研究背景与问题：膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial carcinoma）临床异质性强，涵盖复发性的非肌层浸润性疾病与生物学侵袭性较强的肌层浸润或转移状态。其管理日益整合分子信息与手术、膀胱内治疗、细胞毒化疗、免疫检查点阻断、抗体–药物偶联物及靶向药物，但可靠的疾病分层生物标志物仍有限。尿路上皮癌具有高度免疫原性，肿瘤细胞、浸润白细胞、间质群体、细胞外基质成分及可溶性介质相互作用，形成炎症既可支持抗肿瘤免疫、又可促进进展、免疫逃逸和上皮可塑性的微环境（tumor microenvironment, TME）。调节性细胞死亡（regulated cell death, RCD）与炎症机制交织，但不同死亡方式的炎症后果不同：凋亡（apoptosis）通常为半胱天冬酶（caspase）依赖的细胞解体且膜完整性保留；坏死性凋亡（necroptosis）围绕RIPK1/RIPK3/MLKL信号并导致膜破坏和细胞内危险信号释放；焦亡（pyroptosis）通过gasdermin成孔，常位于炎症小体–caspase信号下游并与炎症细胞因子释放紧密耦合；铁死亡（ferroptosis）由铁依赖磷脂过氧化驱动，并受system x_c^?/谷胱甘肽/GPX4轴等抗氧化防御限制。清除缺陷或溶解性细胞死亡可释放损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns, DAMPs）并放大炎症或免疫原性信号。癌症中这些程序可共存、相互补偿或在恶性、免疫和间质区室中被差异性抑制，从而影响免疫监视、组织损伤、治疗敏感性和适应性耐药。铁死亡在膀胱癌中尤其受到关注，因为铁死亡相关转录模式与肿瘤微环境组成和治疗反应相关。然而，转录本丰度是间接读数：通路相关表达可反映易感性、耐药性、细胞组成或应激适应，而非死亡程序的活跃执行。第二个挑战是可重复性：基因表达研究可识别数千个肿瘤相关差异，但效应量可能因队列组成、检测平台、标准化策略、组织采样、参考组织生物学、肿瘤纯度和细胞混合而变化。膀胱癌分子分类已反复识别基底型、管腔型、间质型、免疫型及相关状态。跨队列评估有助于识别可跨数据集重现的转录改变，但这种转移不等同于临床生物标志物验证。单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）可将bulk来源信号定位至上皮、免疫或间质区室，但小样本单细胞队列仍应解释为探索性而非群体代表性。因此，研究人员提出核心问题：膀胱尿路上皮癌中哪些肿瘤相关转录改变可在独立bulk表达队列间重现，所选候选基因能否在单细胞分辨率下情境化并获得正交体外qRT-PCR支持。研究意义在于区分可重复转录观察与机制性声明，并建立表达层面证据层级。

研究人员开展了一项公共数据二次再分析，独立分析TCGA-BLCA与GSE13507的肿瘤–正常转录差异并评估跨队列方向一致性；在GSE13507中不重选基因评估TCGA来源的15基因肿瘤上调转录特征，并描述其在TCGA病理分期中的分布；在3例患者的5个Pure-UC肿瘤区域中定位所选bulk候选基因及基底型、管腔型、免疫和EMT状态；将凋亡、坏死性凋亡、焦亡和铁死亡作为受约束的解释框架而非数值活性分类器；并对候选基因进行体外qRT-PCR以提供独立于公共转录组数据的表达水平实验验证。研究结论是识别出跨队列可重现的肿瘤相关转录信号，并将候选基因置于异质性细胞背景中；qRT-PCR提供正交表达支持，但转录组或qRT-PCR数据本身均不能确立四种死亡程序的功能性执行。

关键技术方法（≤250字）：研究为公共转录组与临床数据二次再分析。样本队列包括TCGA-BLCA的412例原发肿瘤和19例实体组织正常样本；GSE13507的165例原发膀胱癌和9例正常膀胱黏膜对照（排除标注为多能祖细胞的GSM340542）；GSE293189中3例患者的5个Pure-UC肿瘤区域。各bulk队列独立进行肿瘤–正常差异表达，采用双侧Welch t检验，Benjamini–Hochberg法校正，预设FDR <0.05且|log₂FC| ≥ 0.5。TCGA来源15基因评分在GSE13507中不重选、不重新拟合评估。单细胞分析过滤低质量细胞后保留1,512个细胞，进行标准化、高变基因选择、主成分分析、UMAP、Leiden聚类及Wilcoxon标记与参考标记匹配。四种死亡程序仅作为解释框架。qRT-PCR在SV-HUC-1、T24、5637和UM-UC-3中检测ULBP1、IL37、COL10A1、COL11A1和IGF2BP3，以GAPDH为内参并采用2^?ΔΔCt法计算相对表达。

主要研究结果：（1）多队列设计捕获不同的肿瘤与正常表达结构（Multi-cohort design captures distinct tumor and normal expression structure）：TCGA-BLCA包含412例肿瘤和19例正常组织，病理分期为I期4例、II期129例、III期142例、IV期135例，2例缺分期；GSE13507纳入165例原发癌和9例正常膀胱黏膜对照，另82例其他注释类别未纳入该对比；Pure-UC单细胞保留1,512个细胞，分布于HG_T1（n=91）、HG_T2（n=207）、P12049（n=815）、SG_T1（n=204）和SG_T2（n=195）五个区域。结论是两bulk数据集分析角色不同，单细胞部分具有区域局限。（2）TCGA-BLCA显示广泛的肿瘤相关转录重塑（TCGA-BLCA shows broad tumor-associated transcriptional remodeling）：TCGA肿瘤–正常比较识别5,811个基因满足FDR <0.05且|log₂FC| ≥ 0.5，差异信号分布广泛；显示基因中负效应最强包括PI16（log₂FC = ?6.54）和DES（log₂FC = ?6.51）；TCGA来源15基因评分肿瘤均值1.311、正常0.155；COL10A1的log₂FC = 2.55，95%置信区间2.31–2.78。结论是TCGA定义强肿瘤相关发现信号，后续检验方向及评分行为能否转移至独立平台。（3）外部验证显示正向跨队列效应一致性（External validation demonstrates positive cross-cohort effect concordance）：GSE13507原发–对照比较得7,708个FDR <0.05基因，其中3,379个同时满足|log₂FC| ≥ 0.5；16,759个匹配基因的队列特异性效应正相关（Spearman ρ = 0.58，P < 1 × 10^?300）；4,102个基因在两队列均FDR显著且方向一致；TCGA来源15基因评分在GSE13507肿瘤均值8.029、对照7.870，外部差异较小且绝对値跨平台不可直接比较，但不重选基因的方向转移支持底层肿瘤相关信号的可重复性。（4）TCGA来源特征随所报道病理分期变化（The TCGA-derived signature varies across reported pathologic stages）：患者层面样本选择后403例有分期信息，I期均值1.00（n=2）、II期1.03（n=129）、III期1.42（n=140）、IV期1.45（n=132）；III–IV期较高与更晚期疾病状态相关，但I期仅2例，不能解释为I–IV期平滑生物学进展或临床分期分类。结论是分期分析仅描述生物学分布，不用于诊断 cutoff 或预后声明。（5）单细胞分析揭示显著上皮、免疫和间质异质性（Single-cell profiling reveals pronounced epithelial, immune, and stromal heterogeneity）：1,512个细胞经Leiden分析解析为13个簇（30–230个细胞）；区域中位检测基因数571–1,601，中位总计数628–3,628，中位线粒体比例4.2%–14.4%；最大簇为簇0（n=230）和簇1（n=211）；EPCAM、KRT8、PTPRC、COL1A1和NKG7提供表达背景。标记重叠将13簇归为六类身份：上皮/肿瘤相关细胞（n=746）、髓系细胞（n=228）、T细胞（n=211）、B细胞（n=156）、NK细胞（n=121）和成纤维细胞（n=50）。HG和SG区域上皮/肿瘤相关比例94.2%–100.0%，P12049区域为8.1%且免疫与间质混合最广。最高平均管腔评分见于上皮/肿瘤细胞（0.589），最高EMT评分见于成纤维细胞（1.028），最高免疫评分见于NK细胞（1.229）；上皮/肿瘤细胞中基底评分0.000–1.359、管腔评分0.000–2.619，EMT沿同一连续谱变化；区域层面最高基底和EMT均值见于P12049（0.327和0.607），最高管腔均值见于HG_T2（0.829）。结论是bulk转录变异处于异质性上皮–免疫–间质背景中，区域依赖提示bulk差异可部分源于细胞混合。（6）bulk来源候选基因显示稀疏且细胞类型依赖的单细胞定位（Bulk-derived candidates show sparse and cell-type-dependent single-cell localization）：不施加|log₂FC| ≥ 0.5效应阈值时，TCGA-BLCA有10,608个FDR显著基因，GSE13507有7,708个，两队列均显著者4,573个（不论方向）；11个bulk来源候选基因在六类身份中的平均表达呈细胞类型依赖；15个候选基因单细胞检测分数0.13%–7.61%，SLC1A6最高（7.61%）；基底与管腔评分负相关（r = ?0.35），基底与EMT正相关（r = 0.51），管腔与EMT负相关（r = ?0.57）；两bulk队列还用TCGA来源评分的队列内标准化分布比较以避免平台绝对表达尺度解释。结论是bulk肿瘤–正常效应可反映恶性、间质、免疫或混合区室表达，而非必然的肿瘤细胞自主过程。（7）在细胞死亡–炎症框架内整合跨队列与细胞状态证据（Integrated cross-cohort and cell-state evidence within a cell-death–inflammation framework）：15个共享候选基因的队列内标准化效应被总结；3例Pure-UC子集中平均程序评分为基底0.231、管腔0.320、EMT 0.349、免疫0.411；患者12,049含全部六类身份细胞，为分析患者中混合最广者；15个展示候选在兩bulk队列中均为正log₂FC；证据基础包括412例TCGA肿瘤、19例TCGA正常组织、165例GSE13507原发肿瘤、9例正常膀胱黏膜对照及3例Pure-UC患者。结论是跨队列15基因信号定义可重复肿瘤相关转录层并随分期变化，单细胞免疫和EMT程序定义死亡易感性与炎症输出可能不同的细胞与组织重塑背景，所选候选可经qRT-PCR检验表达方向；这些层次在生物学上与凋亡、坏死性凋亡、焦亡和铁死亡差异调控相容，但因未测量模态特异性蛋白水平执行标志或功能死亡 assay，不能区分这些模态。（8）所选候选基因的体外qRT-PCR验证（In vitro qRT-PCR validation of selected candidate genes）：以SV-HUC-1为非恶性尿路上皮对照、T24、5637和UM-UC-3为膀胱癌模型，qRT-PCR显示ULBP1、IL37、COL10A1、COL11A1和IGF2BP3方向一致上调。相对SV-HUC-1（=1.00），T24中平均倍数变化分别为2.84 ± 0.29、1.96 ± 0.21、4.87 ± 0.51、3.66 ± 0.39、2.58 ± 0.27（P = 0.004、0.012、0.0008、0.0016、0.006）；5637中分别为2.31 ± 0.24、1.74 ± 0.18、3.95 ± 0.44、2.98 ± 0.33、2.22 ± 0.25（P = 0.009、0.021、0.0017、0.0038、0.011）；UM-UC-3中分别为3.12 ± 0.35、2.08 ± 0.23、5.42 ± 0.63、4.21 ± 0.46、3.01 ± 0.31（P = 0.002、0.008、0.0005、0.0009、0.004）。数据来自3个独立生物学重复。结论是五个候选的qRT-PCR变化方向与TCGA-BLCA和GSE13507观察一致，支持受控细胞模型中转录水平可重复性；COL10A1和COL11A1相对增幅最大，IL37增幅较温和但仍一致。

讨论总结：该研究区分可重复转录观察与机制性声明，并明确证据层级。三个中心发现为：TCGA-BLCA与GSE13507虽平台和参考组织不同，肿瘤–正常表达效应广泛一致，16,759个匹配基因效应正相关，4,102个FDR显著基因方向一致；探索性单细胞分析显示bulk来源信号处于高度异质的上皮、免疫和间质景观中，bulk关联可反映细胞内在调节和细胞组成；所选候选进入体外qRT-PCR提供正交表达水平验证。凋亡、坏死性凋亡、焦亡和铁死亡因此被视为生物学相关解释轴而非已测量活性状态。跨队列部分有信息价值，因TCGA-BLCA与GSE13507在技术、样本组成和参考组织上差异显著；GSE13507用于识别进展相关基因分类器，TCGA-BLCA提供以肌层浸润疾病为主的分子图谱；参考组并非生物学等价，TCGA实体组织正常样本与组织学正常膀胱黏膜可能在间质含量、炎症暴露、场效应、采样深度和上皮组成上不同。因此方向一致性支持跨两种采样背景的可重复性，但不证明每个一致基因均为尿路上皮癌特异或肿瘤细胞自主。分期分析应同样克制：III–IV期平均评分较高，但患者层面选择后仅2例I期肿瘤，观察模式可能反映已确立疾病状态差异而非平滑分期轨迹；临床可部署生物标志物需预设系数、锁定cutoff、独立且终点统一的队列、校准和前瞻性评估。单细胞结果为炎症疾病生物学提供主要桥梁：HG和SG区域几乎全为上皮/肿瘤，P12049含多样B细胞、T细胞、NK细胞、髓系、成纤维和上皮群体；NK细胞免疫程序评分最高，成纤维细胞EMT评分最高，上皮/肿瘤细胞管腔评分最高；这些模式与膀胱癌进展源于恶性上皮、细胞因子、免疫浸润和间质重塑相互作用以及基底、管腔、间质和免疫特征定义生物学不同疾病状态的共识框架相容；成纤维细胞相关TGF-β信号亦与转移性尿路上皮癌T细胞排斥和PD-L1阻断反应降低相关。区域依赖意味着bulk信号可因细胞组成及细胞内转录调节而移动。关于四种死亡程序，转录丰度本身不能确立执行；通路相关表达可反映易感、耐药、细胞混合或适应性应激反应。因此可重复候选被解释为与死亡–炎症生物学改变相容的组织状态标志，而非四程序活性分类器。肿瘤纯度和细胞类型组成仍是bulk表达关联的重要潜在混杂因素；单细胞数据显示上皮、免疫和间质组成存在显著区域差异，故部分bulk特征可能追踪成纤维细胞丰度或免疫浸润而非肿瘤细胞内在转录。正式去卷积或肿瘤纯度调整不是本再分析的预设组成部分，因此被列为局限而非推断消除。qRT-PCR候选优先基于跨队列方向一致性、效应一致性、生物学相关性和检测可行性，以减少事后叙述选择；ULBP1和IL37仅作为符合这些标准的例子讨论，并非唯一确立的调节性细胞死亡驱动因素；ULBP1为应激诱导NKG2D配体，与细胞毒免疫识别相关，IL37为抗炎细胞因子并曾在膀胱尿路上皮癌中研究，二者单一转录本均不能识别起始死亡模态。EMT与间质观察补充第二维度，因死亡易感性不太可能独立于细胞状态；膀胱癌EMT长期与侵袭、转移和治疗耐药相关，细胞因子丰富微环境可强化上皮可塑性；本探索性单细胞数据中基底与EMT评分正相关、管腔与EMT负相关且成纤维细胞平均EMT评分最高，这些发现并不表明EMT激活四种死亡程序，而是识别出应测试死亡程序易感性的重塑轴。qRT-PCR提供候选表达差异的直接实验测试，但仍是表达水平 assay；与公共转录组数据一致增强候选表达方向信心，但不证明因果功能或死亡通路执行。局限包括TCGA正常组相对肿瘤组小、GSE13507平台不同且参考组织生物学不同；15基因评分在TCGA选择，未采用嵌套交叉验证或惩罚建模，外部评估针对方向转移而非优化预测；单细胞仅3例患者5个区域，区域细胞组成差异明显且若干候选检测分数低；簇身份由标记重叠分配，未用正交蛋白验证或基于拷贝数变异（copy-number variation, CNV）的恶性细胞推断；bulk表达关联未用正式肿瘤纯度/去卷积框架调整；qRT-PCR测量转录本丰度，不直接量化DAMP释放、细胞因子分泌、脂质过氧化、炎症小体激活、caspase活性、MLKL磷酸化、gasdermin切割或其他识别特定调节性细胞死亡模态所需功能标志。未来应在参考组织生物学可比的独立队列中测试可重复候选，通过重采样评估签名稳定性，并量化肿瘤纯度及免疫/间质分数影响；更大的单细胞或空间数据集应按患者和肿瘤区域定位候选基因，并用正交方法区分恶性与非恶性上皮群体；功能实验应使用通路适宜的蛋白和生化读数检验qRT-PCR支持候选是否因果影响凋亡、坏死性凋亡、焦亡或铁死亡。

研究结论翻译：对TCGA-BLCA和GSE13507的独立分析识别出一个广泛的、方向可重复的肿瘤相关转录景观，以及一个紧凑的TCGA来源转录特征，其分布随所报道病理分期变化。探索性单细胞定位显示，这些信号产生于显著异质的上皮、免疫和间质区室中，这些区室具有不同的免疫和EMT状态。研究将体外qRT-PCR纳入作为所选候选基因的正交表达验证步骤。qRT-PCR进一步显示，相对于SV-HUC-1，ULBP1、IL37、COL10A1、COL11A1和IGF2BP3在ATCC来源膀胱癌细胞系中一致上调，从而为公共数据集观察提供正交转录水平支持。