GmNFYA14通过与GmWRI1a互作负调控大豆种子油脂含量

《Frontiers in Plant Science》：GmNFYA14 negatively regulates soybean seed oil content by interacting with GmWRI1a

　　

摘要：高含油量决定了大豆的商业价值，因此调控油脂积累的机制是品质改良的重要靶标。GmWRI1a是大豆脂质生物合成的核心调控因子，但其协同蛋白仍知之甚少。研究人员利用截短的GmWRI1a作为诱饵进行酵母双杂交筛选，鉴定出GmNFYA14。多种体外（in-vitro）和体内（in-vivo）蛋白互作实验验证了GmNFYA14与GmWRI1a之间的物理互作。研究人员创制了GmNFYA14过表达和CRISPR/Cas9敲除的大豆株系以分析种子储藏成分，并结合双荧光素酶报告基因检测、电泳迁移率变动分析（EMSA）和RNA测序（RNA-seq）等手段解析其调控机制。结果表明，过表达GmNFYA14使种子油脂含量降低2.96%–4.13%，总脂肪酸含量降低9.90%–10.78%，甘油三酯（TAG）含量降低6.32%–8.88%，而蛋白质含量增加3.53%–6.64%。相反，敲除GmNFYA14使总脂肪酸含量增加13.51%–13.90%，TAG含量增加15.82%。GmNFYA14自身并不占据这些脂质基因的启动子，而是与GmWRI1a互作，削弱了GmWRI1a的转录激活活性及其与下游脂质生物合成基因（如GmPKP-β1和GmKAS1）启动子的结合能力。与此一致，转录组分析表明GmNFYA14抑制了受GmWRI1a调控的脂质相关基因的表达，从而限制了种子脂质积累。结论：GmNFYA14是一个通过削弱GmWRI1a活性而非直接结合靶标启动子来负调控大豆油脂积累的因子。该GmNFYA14-GmWRI1a模块为种子脂肪酸合成增添了一层调控层级，并为通过分子育种提高大豆含油量和农艺性状提供了候选靶标。

研究背景与科学问题

大豆是全球最重要的油料作物之一，其种子油占全球油籽产量的一半以上，同时提供超过四分之一的食用和饲用蛋白。随着食品需求和生物柴油原料需求的持续增长，预计未来25年全球植物油产量需翻一番。因此，培育高油优质大豆品种、挖掘高油相关基因并阐明其分子机制具有重要的实践意义。

大豆种子油脂的主要成分为甘油三酯（triacylglycerols, TAG），其生物合成从蔗糖衍生的碳前体开始，经糖酵解中间产物进入质体进行脂肪酸（fatty acid, FA）的从头合成。这一过程受到多种转录因子的精确调控，其中保守的LAFL转录因子网络（包括LEC1、ABI3、FUS3和LEC2）发挥核心作用。WRI1作为LAFL网络的直接下游靶标，被LEC1、LEC2和FUS3转录调控，形成经典的层级调控级联。在大豆中，GmWRI1a可结合靶基因启动子上的AW-box顺式元件或其他保守基序，精确调控碳水化合物流向和脂肪酸从头合成。然而，与GmWRI1a协同作用的蛋白仍知之甚少。

核因子Y（Nuclear Factor Y, NFY）家族成员广泛参与植物胁迫适应、根瘤发育和生长发育等多种生物学过程。大豆NFY基因家族包含68个成员，但功能鉴定的仅有少数。此前研究发现GmNFYA14（又称SW14，基因座Glyma.14G010000）可通过与GmLEC1a/b互作破坏功能性NF-Y复合物，多效性地调控种子油脂、蛋白质含量和百粒重，并参与盐胁迫响应。然而，GmNFYA14在大豆脂质代谢中的调控网络尚不清晰，亟需深入研究。

基于此，研究人员以大豆脂质主效调控因子GmWRI1a为诱饵筛选互作蛋白，聚焦于此前报道的脂质调控因子GmNFYA14，旨在阐明其调控大豆脂质代谢的分子机制。

主要技术方法

研究人员采用酵母双杂交（yeast two-hybrid, Y2H）筛选以截短型GmWRI1a为诱饵鉴定互作蛋白；利用荧光素酶互补成像（luciferase complementation imaging, LCI）、双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation, BiFC）、GST pull-down和免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, Co-IP）等多种体内外蛋白互作实验验证互作关系；通过农杆菌介导的子叶节转化法在大豆品种Williams 82（W82）中创制GmNFYA14过表达（overexpression, OE）和CRISPR/Cas9基因编辑敲除（knockout, KO）转基因株系；采用近红外光谱分析仪测定种子油脂和蛋白质含量，气相色谱-质谱联用（GC-MS）测定脂肪酸组分，液相色谱-质谱联用（LC-MS）测定TAG含量；利用双荧光素酶报告基因检测（dual-luciferase reporter assay）和电泳迁移率变动分析（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）评估GmNFYA14对GmWRI1a转录活性和DNA结合能力的影响；对21天开花后（days after flowering, DAF）的OE48和W82种子进行转录组测序（RNA-seq）分析。

研究结果

3.1 GmNFYA14与GmWRI1a发生物理互作

通过Y2H筛选发现GmNFYA14与截短型GmWRI1a-NT（氨基酸1-323，保留两个AP2结构域但缺失C端转录激活区）在酵母细胞中互作。LCI和BiFC实验证实两者在本氏烟叶片细胞核内互作。GST pull-down实验显示纯化的His-GmWRI1a特异性结合GST-GmNFYA14，Co-IP实验进一步在植物体内证实了二者的物理关联。

3.2 GmNFYA14在大豆脂肪酸和甘油三酯生物合成中的功能作用

CRISPR/Cas9敲除的GmNFYA14_KO株系（携带32-bp缺失）种子总FA含量较W82显著增加13.51%–13.90%（从104.12增至118.33 mg/g干重），TAG含量显著增加15.82%（从73.25增至84.84 mg/g）。三个独立GmNFYA14_OE株系的种子油脂含量较W82降低2.96%–4.13%（相对降幅13.00%–18.14%），蛋白质含量增加3.53%–6.64%（相对增幅9.52%–17.92%）。代表性OE48和OE49株系的总FA含量降低9.90%–10.78%，TAG含量降低6.32%–8.88%。脂肪酸组成方面，亚油酸（18:2）和棕榈酸（16:0）含量显著降低，而油酸（18:1）含量显著升高。

3.3 GmNFYA14作为抑制因子抑制GmWRI1a的转录激活活性

双荧光素酶报告实验表明，单独表达GmWRI1a显著增强proGmPKP-β1驱动的LUC活性，单独表达GmNFYA14对该启动子无影响，而二者共表达则显著降低GmWRI1a介导的LUC活性，证明GmNFYA14通过抑制GmWRI1a而非直接作用于启动子来发挥抑制作用。

3.4 GmNFYA14抑制GmWRI1a的DNA结合能力

EMSA结果显示，GmWRI1a可特异性结合来自GmPKP-β1、GmKAS1、GmKASIII-2和GmACBP1四个靶基因启动子中含AW-box的探针。加入未标记竞争探针可减弱结合信号，而加入纯化的GmNFYA14蛋白则降低了GmWRI1a与标记探针的结合亲和力。GmNFYA14本身不与这些探针结合，也未形成更慢迁移的复合物，表明其通过二元互作直接削弱GmWRI1a的DNA结合能力。

3.5 GmNFYA14调控油脂生物合成相关基因表达

对21 DAF种子的转录组分析显示，OE48相对于W82有4,418个基因上调、5,933个基因下调。KEGG富集分析表明脂质代谢相关通路显著富集。大多数脂肪酸生物合成和TAG合成相关基因在OE48中下调，包括EMSA所检测的全部四个GmWRI1a靶基因（GmPKP-β1、GmKAS1、GmKASIII-2和GmACBP1），且在独立OE49株系中通过qPCR得到验证。

讨论与结论

讨论部分指出，GmNFYA14此前已知可与GmLEC1a/b互作并破坏非经典NFY复合物的组装，从而抑制GmLEC1依赖的转录激活和脂肪酸生物合成基因的下调。本研究在此基础上扩展了这一调控网络，发现了以GmWRI1a为中心的新途径：GmNFYA14直接与GmWRI1a互作，抑制其对GmPKP-β1等脂肪酸和TAG生物合成基因的转录活性。这种同时干扰LEC1介导的种子成熟途径和GmWRI1a驱动的脂质合成途径的双靶点机制，阐明了GmNFYA14在大豆种子油脂积累中的整合功能。

关于抑制机制，研究表明GmNFYA14通过直接蛋白-蛋白接触抑制GmWRI1a活性，而非通过启动子结合的阻遏方式。GmNFYA14自身不结合AW-box探针也不改变proGmPKP-β1活性，其抑制作用仅在GmWRI1a存在时才显现。在仅含纯化重组蛋白的无细胞体系中，GmNFYA14即可削弱GmWRI1a-DNA结合，表明此抑制不需要染色质或植物特异性的辅阻遏物。GmNFYA14与GmWRI1a互作的区域包含两个AP2 DNA结合结构域，支持其通过空间位阻或诱导构象变化干扰GmWRI1a结合DNA的模型。

研究人员还提出了GmNFYA11与GmNFYA14形成的双向调控模块：GmNFYA11正调控油脂合成，通过激活GmOLEO1转录和增强GmWRI1a转录活性来提高油脂水平；而GmNFYA14负调控油脂合成，通过削弱GmWRI1a的启动子结合和转录激活能力来抑制脂肪酸和TAG合成。两者可能竞争结合GmWRI1a以维持脂质合成稳态。

结论部分翻译如下：为了探究关键脂质调控因子GmWRI1a功能的分子机制，本研究鉴定出GmNFYA14为其互作蛋白。通过对GmNFYA14过表达和敲除转基因大豆植株的种子油脂含量、总脂肪酸水平和TAG积累的测定，结果表明GmNFYA14通过抑制总脂肪酸和TAG的生物合成来负调控大豆油脂积累。机制分析表明，GmNFYA14与GmWRI1a的互作抑制了GmWRI1a对其靶基因GmPKP-β1的转录调控活性，并削弱了GmWRI1a与下游靶标启动子的结合能力。转录组分析进一步证实，过表达GmNFYA14显著下调了受GmWRI1a靶向的脂质合成相关基因的表达。鉴于GmNFYA14/SW14在调控油脂含量、蛋白质含量和种子重量方面的多效性，GmNFYA14-GmWRI1a模块应被视为高油育种的一个有前景的切入点。总之，本研究为GmNFYA14调控大豆油脂积累的分子机制提供了新的见解，完善了植物脂质代谢的转录调控网络，并为高油大豆的分子改良提供了有价值的遗传资源和理论参考。