《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：In vitro investigation of the host-pathogen interaction in human strongyloidiasis at the intestinal level
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引言： 人类粪类圆线虫病是一种由寄生虫粪类圆线虫（Strongyloides stercoralis）引起的慢性持续性感染，其特点在于独特的自体感染周期。寄生虫与宿主之间的相互作用因此应包含适应机制，以耐受该线虫的长期存在。然而，目前对这种相互作用背后机制的认
引言： 人类粪类圆线虫病是一种由寄生虫粪类圆线虫（Strongyloides stercoralis）引起的慢性持续性感染，其特点在于独特的自体感染周期。寄生虫与宿主之间的相互作用因此应包含适应机制，以耐受该线虫的长期存在。然而，目前对这种相互作用背后机制的认识仍然有限。为了获得关于粪类圆线虫与人类宿主相互作用的新见解，研究人员采用了多组学方法来探索粪类圆线虫感染性幼虫（iL3）及其细胞外囊泡（EVs）对人类肠道上皮细胞的调控作用。
方法： 从临床粪便样本中分离出的粪类圆线虫iL3在体外维持培养长达一周，以使其在条件培养基中释放EVs。随后，将人肠道上皮细胞（Caco-2）分别暴露于iL3或其EVs中，持续6小时、24小时或72小时。
结果： 在本研究设置中，iL3和EVs随时间触发了不同的反应。共孵育6小时后，iL3诱导了促炎细胞因子（即IL-8和CXCL10）的释放，而EVs仅诱导了CXCL10的释放，且强度低于活幼虫。通过转录组学和蛋白质组学对基因表达调控进行评估发现，活幼虫诱导了细胞活化和促炎样特征，并在暴露后72小时达到峰值；而EVs则表现出更早的作用，其mRNA和蛋白质表达的调控主要在刺激后24小时，并导致细胞活化、代谢和免疫应答的显著抑制。
讨论： 这些发现突显了iL3和EVs在人类粪类圆线虫病局部宿主-病原体相互作用中介导的不同效应。通过显示主要的细胞活化下调，研究人员假设EVs可能在免疫逃逸中发挥作用。需要进行更深入的研究来验证这些发现，并进一步阐明寄生虫源性EVs在人类粪类圆线虫病病理生理学中的作用。
一、研究背景与科学问题
人类粪类圆线虫病是由线虫寄生虫粪类圆线虫（Strongyloides stercoralis）引起的一种被忽视的热带病，全球估计有3.8亿至6亿人受感染。该寄生虫具有复杂的生活史，包括自由生活和寄生阶段，其独特的自体感染周期导致慢性持续性感染。在免疫功能低下的个体中，可发展为致命的重度粪类圆线虫病（播散型或超感染综合征）。目前，对该病肠道局部宿主-病原体相互作用机制的认知仍十分有限。虽然动物模型（如鼠类中的S. ratti或S. venezuelensis感染）揭示了一些关键免疫机制，但这些模型无法完全复现人类感染的特征，例如鼠类感染不经历自体感染周期，最终会被清除。此外，寄生虫衍生的排泄/分泌产物（ESP），特别是其中的细胞外囊泡（EVs），被认为是宿主-病原体相互作用的重要介质，但在粪类圆线虫病中尚未得到充分研究。为此，本研究旨在利用多组学方法，探讨粪类圆线虫感染性幼虫（iL3）及其EVs对人肠道上皮细胞系的调控作用，以期揭示该病在肠道水平的局部相互作用机制。
二、研究设计与技术方法
研究人员从一名感染患者的粪便样本中分离出粪类圆线虫iL3，经鉴定其基因型为H1_A(i)_VI。将iL3在体外维持培养以收集条件培养基，并通过差速超速离心法富集EVs，利用纳米颗粒追踪分析（NTA）和透射电子显微镜（TEM）对其粒径和形态进行表征。随后，用人结肠腺癌细胞系（Caco-2）作为肠道上皮细胞模型，分别暴露于iL3或EVs，并设置IFNγ处理作为促炎阳性对照，在6小时、24小时和72小时三个时间点进行检测。研究采用Luminex多重检测评估细胞因子释放，通过RNA测序（RNA-seq）进行转录组学分析，并使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行定量蛋白质组学分析，最后通过Ingenuity Pathway Analysis（IPA）进行通路富集分析。
三、主要研究结果
3.1 EVs可从iL3条件培养基中高效富集
NTA结果显示，富集的EVs平均粒径为132.1 nm，众数粒径为106.0 nm。TEM成像确认了杯状颗粒的存在，尺寸范围与NTA测量一致。
3.2 Caco-2细胞响应iL3及其EVs释放促炎细胞因子
细胞活力检测未发现iL3或EVs对Caco-2细胞产生显著的细胞毒性。在检测的六种细胞因子中，IL-6、IL-33和TSLP在所有条件下均未检测到释放。CXCL10和IL-8被检测到。与未刺激细胞相比，iL3和EVs均在24小时和72小时诱导了Caco-2细胞显著更高量的CXCL10释放，但EVs诱导的量低于iL3。IL-8仅在iL3刺激下显著释放，在24小时和72小时均有统计学差异。
3.3 转录组谱在iL3或EVs暴露后发生调控
主成分分析（PCA）和层次聚类分析（HCA）揭示了时间和刺激依赖性的转录响应。EVs处理的细胞在24小时形成独立簇。差异表达分析显示，iL3暴露导致随时间递增的基因调控，在72小时达到峰值，共有1,852个差异表达转录本（上调1,086个，下调766个）。相比之下，EVs刺激引发的响应较为温和，在24小时最为显著，共有425个差异表达转录本，其中376个为下调。
3.4 iL3及其EVs调控Caco-2细胞的蛋白表达
蛋白质组学分析定量了7,334个人源蛋白。PCA和HCA分析显示，EVs处理的样品基于刺激本身聚类，而iL3和IFNγ处理的样品则基于暴露时间聚类。iL3暴露在72小时引起最强的蛋白表达变化（121个差异蛋白），而EVs在24小时引起最强变化（113个差异蛋白）。
3.5 通路分析揭示EVs和活幼虫诱导的独特时序性和生物学响应
IPA通路分析显示，EVs和iL3诱导了截然不同的通路调控模式。对于EVs，其在转录组和蛋白质组水平均以抑制作用为主，尤其在24小时最为显著。抑制的通路涉及RNA生物合成与加工、DNA修复、线粒体翻译、免疫信号传导（如急性期反应信号、IL-1信号、I类MHC介导的抗原呈递）、呼吸电子传递等。对于iL3，其诱导的通路调控以激活为主，且在72小时最强。激活的通路主要包括先天性和炎症性免疫应答（如病原体诱导的细胞因子风暴信号、IL-17A信号、iNOS信号）、上皮重塑和宿主-寄生虫相互作用（如整合素信号、上皮-间充质转化调控）、细胞增殖与存活（如PI3K/AKT信号）以及能量代谢（如糖酵解、氧化磷酸化）。值得注意的是，颗粒酶A信号和NET形成通路在iL3和EVs处理下呈现出相反的激活状态。
四、讨论与研究结论
本研究首次描述了来自临床分离株的粪类圆线虫iL3及其EVs如何作用于人肠道上皮细胞。研究发现，两种刺激物触发了不同的宿主细胞响应：活幼虫（iL3）倾向于促进细胞活化和促炎样特征，类似于促炎刺激物IFNγ的作用，这体现了上皮细胞感知和识别蠕虫病原体的重要功能；而寄生虫源性的EVs则主要表现为对细胞代谢和免疫响应的下调作用，尤其是在早期时间点（24小时）。这种抑制效应可能涉及SUMO化修饰、抗原呈递、免疫原性细胞死亡以及线粒体活性等多个层面的调控。研究人员据此提出假设，即EVs可能是粪类圆线虫用于免疫逃逸、促进其在宿主体内长期存活的策略之一，这与在其他蠕虫寄生虫中观察到的现象一致。
尽管本研究存在局限性，如仅使用了单一临床分离株、单一的Caco-2细胞系模型、缺乏体内其他细胞类型的相互作用等，但其优势在于直接使用了来源于感染患者的临床寄生虫株，而非实验室适应株，增加了研究的生物学相关性。研究结论强调，EVs介导的效应并不一定重现完整活幼虫的效果，提示EVs是寄生虫与宿主互作的一种特殊机制。未来的研究需要在更复杂的模型系统中验证这些发现，并进一步阐明EVs在粪类圆线虫病病理生理学中的确切作用。
