神经发育障碍相关非编码变异功能验证：ASE与DEG检测效能的比较及CRISPR等位基因标记的应用

《Genome Medicine》：Evaluating gene expression-based approaches for functional assessment of non-coding variants in neurodevelopmental disorders

摘要

背景

与神经发育障碍相关的非编码变异难以解读，因为其调控效应较为微妙，且依赖于位点特异性和阶段特异性的表观遗传背景。邻近基因的转录失调是功能相关性的最可靠标志。RNA-seq研究通常通过差异基因表达（DEG）分析来检测这一现象，但该分析方法需要健康对照组，并且通常需要两倍以上的表达变化。等位基因特异性表达（ASE）分析可通过直接比较同一份样本中完整染色体和受影响染色体上等位基因的表达，从而检测更为微妙的效应。我们利用真实的RNA-seq数据、计算机模拟和一个临床病例评估了ASE的检测效能。

方法

我们将诱导多能干细胞（iPSCs）和神经祖细胞（NPCs）的转录组分析，与基因表达变化的计算机建模相结合，以估算统计效能。我们比较了两种策略：变异携带者与非携带者之间的DEG分析，以及杂合子个体内部的ASE分析。为了进行临床验证，我们使用CRISPR-Cas9碱基编辑技术在患者来源的NPCs中引入一个与候选调控变异相邻的同义单核苷酸变异（SNV），并进行了靶向RNA-seq。

结果

模拟和实验数据显示，对于大多数基因，DEG具有更高的检测效能，即使存在显著的个体间或生物学变异也是如此。仅对于含有杂合SNV且测序深度较高的基因，ASE才优于DEG。在一名携带AUTS2附近易位断裂点的患者中，我们构建了带有SNV标记的AUTS2等位基因的iPSC和NPC细胞系，并设计了一种低成本的靶向富集分析方法用于高灵敏度ASE检测，但两种方法均未检测到与当前生物学模型下表型一致的基因失调。

结论

我们的结果表明，DEG和ASE检测是互补而非竞争的策略。我们还展示了通过CRISPR/Cas9介导的等位基因标记，在全转录组和靶向RNA测序中实现高灵敏度ASE检测的实用路径。这一框架有助于研究人员为神经发育障碍相关非编码变异的功能验证，选择具有成本效益的转录组学设计方案。