《BMC Chemistry》：Unlocking delafloxacin fluorescence with 9-fluorenyl methyl chloroformate: A sensitive spectrofluorimetric method for pharmaceutical and plasma analysis with greenness and whiteness assessment
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背景：研究人员开发了一种基于9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC-Cl）荧光衍生化的高灵敏光谱荧光测定法，用于德拉沙星（DEL）的定量分析。衍生化反应在硼酸盐缓冲液（pH 8.0）中于室温下进行，生成具有强荧光特性的衍生物，适用于高灵敏定量分析。
结果：所生成的荧光衍
背景：研究人员开发了一种基于9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC-Cl）荧光衍生化的高灵敏光谱荧光测定法，用于德拉沙星（DEL）的定量分析。衍生化反应在硼酸盐缓冲液（pH 8.0）中于室温下进行，生成具有强荧光特性的衍生物，适用于高灵敏定量分析。
结果：所生成的荧光衍生物最大激发和发射波长分别为264 nm和314 nm。研究人员系统考察并优化了影响衍生化反应及荧光响应的实验参数。该方法在5.0–100.0 ng mL?1浓度范围内呈现良好线性，相关系数为0.9994。检测限和定量限分别为1.25 ng mL?1和3.81 ng mL?1。该方法表现出令人满意的准确度和精密度，平均回收率为101.43% ± 0.64。通过测定药物制剂及加标人血浆样品中的德拉沙星，成功验证了该方法的适用性。与已报道的参考方法进行统计学比较，结果显示两者之间无显著差异。此外，研究人员采用碳足迹削减指数（CaFRI）和白色分析化学评估（WECA）对该方法的环境性能进行了评价，结果表明其具有良好的分析性能与环境友好特性。
结论：所提出的荧光衍生化方法为药物制剂及加标血浆中德拉沙星的测定提供了一种灵敏、精密且准确的途径。其良好的分析性能与环境评估结果支持该方法在常规药品质量控制及生物分析研究中的潜在应用。
论文解读
一、研究背景与问题提出
抗生素耐药性问题日益严峻，全球范围内对新型高效抗菌药物的需求愈发迫切。联合国已发出警告，若不开发新型抗菌化合物，到2050年全球每年可能因耐药感染导致1000万人死亡。在此背景下，美国食品药品监督管理局（US-FDA）批准了德拉沙星（delafloxacin，DEL）作为一种具有独特非两性离子化学结构的氟喹诺酮类抗菌药物。DEL能够同时抑制细菌必需的拓扑异构酶II和IV，因此对临床耐药菌感染具有更广泛的疗效，已被批准用于治疗肺炎及皮肤感染等疾病。
然而，DEL的定量分析方法存在诸多局限。已有报道的方法包括光谱荧光法、电位法和色谱法等，但这些方法各有不足：高效液相色谱法（HPLC）成本高昂且因使用大量有机溶剂而环境友好性较差；部分方法检测限较高（如LOD=140 ng mL?1），灵敏度受限；某些衍生化试剂（如荧光胺）价格昂贵；部分方法需要高温加热等繁琐操作步骤。相比之下，光谱荧光分析法具有灵敏度高、选择性好、操作简便、信号检测快速及在学术和研究环境中可及性广等固有优势。
基于上述背景，研究人员选择9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC-Cl）作为荧光衍生化试剂。FMOC-Cl是一种关键的衍生化试剂，常用于识别伯胺和仲胺以及药物活性物质。由于DEL分子中含有伯胺基团，研究人员旨在开发一种基于FMOC-Cl衍生化的光谱荧光测定方法，实现对药物制剂和加标血浆中DEL的灵敏、简便、准确、快速测定。此外，该方法符合绿色分析化学原则，具有低化学试剂和能源消耗的特点。
二、主要技术方法
研究人员采用英国爱丁堡FS5光谱荧光仪（配备Fluoracle软件、1 cm石英池和150 W氙灯光源）进行荧光测量，仪器扫描速度为1000 nm/min，狭缝宽度固定为2 nm。DEL原料药（纯度99.50%）购自美国新泽西州Melinta Therapeutics公司，Baxdela?片剂和注射剂购自沙特阿拉伯药房，FMOC-Cl购自美国Sigma公司。研究中使用了0.2 M硼酸盐缓冲液（pH 8.0和pH 12）、乙腈等试剂。DEL标准储备液（50.0 μg mL?1）通过精密称取5.0 mg DEL溶于100 mL蒸馏水并超声5 min制备，中间工作液浓度为1.0 μg mL?1（1000.0 ng mL?1）。校准标准品在5.0–100.0 ng mL?1范围内新鲜制备。衍生化过程为：向10 mL容量瓶中加入DEL标准溶液，依次加入1.5 mL硼酸盐缓冲液（pH 8.0）、2 mL 0.1 μg mL?1 FMOC-Cl溶液和2.5 mL乙腈，在25 °C下反应15 min后以蒸馏水定容，在激发波长264 nm和发射波长314 nm处测量荧光强度。药物制剂分析中，取10片Baxdela?片剂称重、粉碎、混匀，精密称取约5 mg DEL粉末溶于100 mL蒸馏水，经0.45 μm滤膜过滤后进行荧光分析；注射剂分析中，将300 mg Baxdela?瓶装内容物定量转移至100 mL容量瓶制备储备液并进一步稀释至工作浓度范围。加标人血浆分析中，从32岁健康志愿者前臂采集5 mL无药血液至肝素化试管中，以4000 rpm离心30 min分离血浆，取500 μL血浆上清液与1.0 mL不同浓度DEL标准溶液混合，加入3.0 mL乙腈沉淀血浆蛋白，涡旋2 min后以4000 rpm离心10 min，取上清液过滤后进行荧光测量，覆盖10、20、40、60和80 ng mL?1五个浓度水平。
三、研究结果
方法学优化结果
研究人员对影响衍生化反应和荧光响应的各项实验参数进行了系统优化。在pH效应研究中，考察了一系列碱性pH值对DEL-FMOC衍生物荧光强度的影响，结果发现荧光强度在pH 8.0时达到最大值，随后随pH升高至12.0而逐渐降低，因此选择pH 8.0为最佳pH。这一pH依赖性可通过DEL氨基与FMOC-Cl的反应机理解释：在弱碱性条件下，氨基以未质子化形式存在的比例增加，亲核性增强，更易与FMOC-Cl反应，促进荧光衍生物生成；而在更高pH条件下，FMOC-Cl的碱性水解增强，生成9-芴基甲醇（FMOC-OH），与目标衍生化反应竞争，导致荧光强度下降。在缓冲液类型比较中，0.2 M硼酸盐缓冲液产生的荧光响应高于0.2 M磷酸盐缓冲液，因此选择硼酸盐缓冲液。缓冲液体积从0.5 mL增至2.5 mL时荧光强度逐渐提高，最终选择1.5 mL为最佳体积。FMOC-Cl溶液体积在0至1.8 mL范围内增加时荧光强度随之增大，在1.8至2.2 mL范围内基本保持恒定，因此选择2.0 mL为最佳试剂体积。乙腈体积增加可增强荧光响应，2.5 mL时获得最高且最可靠的荧光强度。反应时间研究中，DEL-FMOC衍生物在10 min时达到最大荧光强度并在后续20 min内基本保持稳定，研究人员选择15 min作为最佳实际反应时间，该时间处于荧光稳定平台期内，可为一致且可重复的衍生化提供额外余量。温度效应研究显示，将反应温度从25 °C升高至50 °C会导致荧光强度降低，因此确定25 °C为最佳反应温度。每项优化条件均采用三次独立重复实验（n=3）评估。
方法验证结果
根据国际协调会议（ICH）指南，研究人员对方法进行了全面验证。在5.0–100.0 ng mL?1浓度范围内，荧光强度与药物浓度呈现良好线性关系，相关系数为0.9994。基于校准曲线斜率和截距标准差计算，检测限（LOD）为1.25 ng mL?1，定量限（LOQ）为3.81 ng mL?1，表明该方法具有良好灵敏度，适用于血浆样品中低浓度DEL的测定。准确度评估中，对线性范围内的五个浓度水平（10.0、20.0、40.0、60.0和80.0 ng mL?1）进行三次独立制备和测定，计算回收率接近100%，平均回收率为101.43% ± 0.64。精密度评估中，对三个浓度水平（30.0、50.0和70.0 ng mL?1）进行日内和日间精密度考察，各浓度均独立制备三次，日内和日间RSD%均未超过2%，表明方法具有良好的精密度和重现性。稳健性测试中，对pH、缓冲液和FMOC-Cl体积等变量进行微小改变，结果显示这些变量的变化不会对DEL测定产生显著影响。
药物制剂分析结果
研究人员将所建立的方法应用于含DEL的药物制剂（片剂和注射剂）分析，并使用已报道的方法对相同制剂进行测定。通过95%置信水平下的学生t检验和F检验比较两种方法的结果，两种方法的准确度和精密度均无显著差异。此外，研究结果表明片剂和注射剂中的辅料对测定无明显的干扰作用，验证了该方法在不同药物剂型中精确、准确测定DEL的能力。
加标人血浆分析结果
考虑到口服450 mg DEL每12小时给药后最大血浆浓度（Cmax）约为7.45 ± 3.16 μg mL?1，静脉注射300 mg每12小时稳态时Cmax约为9.29 ± 1.83 μg mL?1，研究人员构建了基质匹配校准曲线以评估该方法在血浆样品中测定DEL的适用性。空白人血浆样品在五个浓度水平（10.0、20.0、40.0、60.0和80.0 ng mL?1）加标DEL，经完整样品前处理和荧光衍生化后测量。血浆校准曲线方程为FI = 2.0466X + 57.26，决定系数R2 = 0.9992，表明在所考察浓度范围内线性良好。平均回收率范围为97.50%至99.60%，RSD%为0.65%至1.46%，表明该方法在血浆基质中具有良好的准确度和精密度。
绿色性与可持续性评估结果
研究人员采用碳足迹削减指数（CaFRI）和白色分析化学评估（WECA）工具对方法的环境性能进行了综合评价。评估考虑了所用溶剂和试剂的种类与数量、样品制备需求、废物产生及整个分析流程。与需要大量有机溶剂萃取或高体积色谱流动相的方法相比，该方法在反应介质中使用的乙腈量有限，样品制备更简便，废物产生更少。WECA计算公式为：WECA(%) = (R?·wR + ?·wG + B?·wB)/(wR + wG + wB)，其中R?、?和B?分别代表红色（分析性能）、绿色（生态可持续性）和蓝色（实际效率）三个域的平均得分，wR、wG和wB为相应的权重因子。此外，研究还引入了NQS指数作为对方法符合可持续发展目标（UN-SDGs）的深入评估，该指标整合了社会需求、分析质量和环境可持续性三个关键维度，以三角金字塔形式图形化呈现。与已报道方法相比，所开发方法在金字塔顶端附近的位置反映了其在三个维度上的优越性能。
方法比较结果
与已报道的基于乙基乙酰乙酸酯/甲醛、NBD-Cl和荧光胺的方法相比，基于FMOC-Cl的所提出方法显示出明显的分析优势。本方法的检测限（1.25 ng mL?1）远低于其他方法，显著提高了灵敏度和痕量水平测定能力。线性范围（5.0–100.0 ng mL?1）虽然较其他试剂报道的范围窄，但专门面向较低浓度，这对于高灵敏度至关重要的痕量分析物识别非常有利。
四、讨论与结论
讨论部分指出，该方法以FMOC-Cl为荧光衍生化试剂，操作简便，无需有机溶剂萃取步骤。方法的卓越灵敏度使其能够分析药物制剂和加标血浆中的DEL。衍生化反应的稳定性和简便性使其适用于生物体液中DEL药物的高灵敏色谱分析预处理。该方法除具有良好绿色性特征外，还可用于质量控制部门以消除危险和致癌物质。所使用的仪器、溶剂和试剂经济实惠。方法验证结果显示了令人满意的回收率和相对标准偏差。
研究结论表明，利用FMOC-Cl作为荧光衍生化试剂，研究人员开发了一种新颖的光谱技术。该方法简便且无需有机溶剂萃取程序。其卓越的灵敏度使得DEL在药物制剂和加标血浆中的分析成为可能。衍生化反应的稳定性和易操作性使其适用于生物体液中DEL药物的高灵敏色谱分析预处理。该方法除具有良好绿色性特征外，还可应用于质量控制部门以消除危险和致癌物质。所用仪器、溶剂和试剂经济实惠。方法验证显示了令人满意的回收率和相对标准偏差。
