《Horticulture Advances》：A rapid and broadly applicable in planta transformation and genome editing system involving wounded epicotyls in citrus
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柑橘的遗传转化在很大程度上依赖于基于离体组织培养的方法，这些方法劳动密集、耗时，并且受到基因型依赖性再生能力的强烈影响。本研究利用创伤柑橘子叶开发了一种快速且广泛适用的原位（in planta）转化系统。通过基于琼脂糖的局部腔室，将农杆菌（Agrobacter
柑橘的遗传转化在很大程度上依赖于基于离体组织培养的方法，这些方法劳动密集、耗时，并且受到基因型依赖性再生能力的强烈影响。本研究利用创伤柑橘子叶开发了一种快速且广泛适用的原位（in planta）转化系统。通过基于琼脂糖的局部腔室，将农杆菌（Agrobacterium）、植物生长调节剂和抗生素依次递送至创伤子叶，以促进转化、再生和选择。3.0 mg/L 6-苄氨基嘌呤（6-benzylaminopurine）与0.05 mg/L 1-萘乙酸（1-naphthaleneacetic acid）的优化组合在Carrizo枳橙中实现了13.92%的非嵌合转化效率。该系统在另外5种柑橘基因型中进一步得到验证，包括甜橙、柚、柠檬、香橙（Citrus junos）和金柑，非嵌合转化效率范围为2.58%至18.68%。转基因植株在播种后约40 d内获得。此外，该系统支持高效的CRISPR/Cas9介导的基因组编辑，并成功获得了推定无转基因的LATE MERISTEM IDENTITY1（CsLMI1）编辑植株，该植株表现出无油腺表型。这一快速高效的平台为柑橘功能基因组学和基因组编辑提供了有价值的工具，并可能促进其他多年生木本物种的遗传改良。
论文解读
一、研究背景与问题
柑橘是全球最重要的果树作物之一，但传统柑橘育种主要依赖自然种质资源的利用和自发芽变突变体的筛选。柑橘漫长的童期、高度杂合性、珠心多胚性以及理想芽变频率低等特性，使得其遗传改良效率低下且劳动密集。遗传工程和基因组编辑技术为传统育种提供了高效替代方案，能够实现目标性状的定向修饰和基因功能的快速解析。近年来，CRISPR/Cas9基因组编辑已在柑橘中成功应用于株型改良和抗病性增强等方面。
然而，大多数农杆菌介导的柑橘转化系统依赖以子叶节段、节间或胚性组织为外植体的组织培养流程。这些方法需要严格的灭菌操作，通常耗时数月，涉及每两周将外植体转移至新鲜培养基以及筛选数百个再生植株以获得转基因植株。在某些基因型中，再生芽还需要额外的离体生根或微嫁接步骤，进一步增加了技术复杂性。原位转化提供了一种替代策略，转化芽可直接从创伤幼苗上再生，无需传统组织培养。已有研究在柚、柠檬、甜橙、Carrizo枳橙等物种中建立了原位转化方法，但许多现有方法未能持续供应植物激素以促进芽再生，抗生素也常通过滴加或棉签擦拭方式间歇施用，这可能妨碍激素可用性和选择压力的维持，从而限制转化效率。基于上述问题，研究人员旨在开发一种快速、广谱适用的柑橘原位转化系统，将创伤转化框架与组织培养中常用的植物激素处理相结合。
二、研究内容与主要结论
研究人员建立了一种快速且广泛适用的柑橘原位转化系统。在最优条件下，该系统在Carrizo枳橙中实现了13.92%的非嵌合转化效率，转基因植株在播种后约40 d内即可获得。该系统成功应用于甜橙、柚、柠檬、香橙和金柑等5种额外柑橘基因型，非嵌合转化效率范围为2.58%至18.68%。此外，该系统支持高效的CRISPR/Cas9介导的基因组编辑，并利用CsLMI1功能缺失突变体无油腺表型作为早期形态学标记，成功获得了推定无转基因的CsLMI1编辑植株。这一平台为柑橘功能基因组学和基因组编辑提供了高效工具，并可能促进其他多年生木本物种的遗传改良。
三、主要关键技术方法
研究人员使用了以下关键技术方法：以Carrizo枳橙为主要材料，种子来源于华中农业大学柑橘科学研究所及美国TreeSource柑橘苗圃，另以Valencia甜橙、'Shatian'柚、'Eureka'柠檬、'Ziyang Xiangcheng'（Citrus junos）和金柑为验证材料。采用农杆菌EHA105菌株介导的转化，使用基于YAO启动子的CRISPR/Cas9编辑系统，构建靶向CsZFP7和CsLMI1的编辑载体，部分载体还包含p35S:FT（FLOWERING LOCUS T）过表达 cassette 以缩短童期。核心方法为利用20 μL移液器吸头作为局部腔室，依次装载农杆菌悬浮液、含乙酰丁香酮的琼脂糖共培养培养基和含卡那霉素的琼脂糖选择培养基，对去顶幼苗的创伤子叶进行接种、共培养和选择。利用GFP/RFP荧光标记进行阳性组织筛选，通过荧光引导修剪去除阴性芽以富集阳性芽。基因分型采用Hi-TOM平台和Sanger测序结合ICE工具分析，候选无转基因植株通过Oxford Nanopore Technologies（ONT）长读长全基因组重测序验证外源DNA整合情况。
四、研究结果
快速原位转化系统的建立：研究人员将柑橘种子播种于土壤中，在26 °C、16 h光照/8 h黑暗光周期下生长10–15 d至5–7 cm高度后，用刀片在第一片真叶下方横向切割，保留约2–3 cm子叶。将装有农杆菌悬浮液的20 μL移液器吸头倒置套在创伤子叶上，切面浸入菌液1 h。随后依次更换为含琼脂糖共培养培养基的吸头（暗培养3 d）和含琼脂糖选择培养基的吸头（暗培养5 d）。选择结束后移除吸头，覆盖透明塑料膜转移至光照条件。约2周后可鉴定荧光阳性再生芽，4周后再生芽可移栽至单独花盆。
创伤子叶形成层区域GFP阳性愈伤组织和芽再生：转至光照条件后3 d，伤口表面开始隆起但无GFP阳性组织；6 d时，GFP阳性愈伤组织首先出现在创伤子叶的形成层区域；9至12 d逐渐发育为明显的GFP阳性芽。所有观察样本中GFP阳性愈伤组织均起源于形成层区域而非皮层或髓部，表明形成层区域是转化组织再生的主要位点。
Carrizo枳橙原位转化的最优条件：研究人员将0.6、3.0和6.0 mg/L三种浓度的6-BA与0.05、0.1和0.2 mg/L三种浓度的NAA组合为9种处理。结果显示，0.6 mg/L 6-BA处理下再生效率为82.02%至91.14%，转化效率为3.80%至6.74%；3.0 mg/L 6-BA与0.05 mg/L NAA组合从79株处理幼苗中获得11株非嵌合GFP阳性植株，转化效率最高达13.92%，另获得8株嵌合GFP阳性植株；NAA浓度升高至0.1或0.2 mg/L会降低转化效率；6.0 mg/L 6-BA处理下再生效率显著下降至42.37%至56.67%，转化效率为0至5.98%。这表明过高浓度的6-BA抑制子叶伤口芽再生，而过量NAA抑制农杆菌介导的转化效率。对101株转基因植株的Hi-TOM测序显示，80株在CsZFP7位点存在编辑事件，65株编辑效率高于50%，42株编辑效率达100%，29株在转化后3个月内开花。
去除非荧光芽促进荧光阳性芽生长：研究人员观察到单个子叶伤口常同时再生多个不定芽，荧光阳性和阴性芽在同一再生表面同时发育。去除邻近荧光阴性芽后，荧光阳性芽快速生长并逐渐成为伤口优势芽。部分再生芽呈嵌合荧光模式，当嵌合芽上观察到荧光阳性腋芽时，去除荧光阴性顶端部分可促进阳性芽生长，腋芽随后发育为非嵌合GFP阳性芽。这种选择性修剪策略不仅促进了荧光阳性芽的生长，还使从初始嵌合再生体中恢复非嵌合荧光阳性芽成为可能。
系统对不同柑橘基因型的适用性：研究人员在Valencia甜橙、'Shatian'柚、'Eureka'柠檬、'Ziyang Xiangcheng'（Citrus junos）和金柑5种额外基因型中验证了优化系统，所有基因型均成功获得非嵌合GFP阳性植株。转化效率因基因型而异，'Shatian'柚最低为2.58%，'Ziyang Xiangcheng'最高为18.68%，金柑和Valencia甜橙分别为11.34%和7.32%，'Eureka'柠檬为3.24%。再生植株生长正常，生长1年后仍保持可检测的GFP荧光。
通过原位转化获得无转基因CsLMI1编辑植株：研究人员利用CsLMI1功能缺失导致油腺减少或缺失的表型作为早期形态学标记，对275株Carrizo枳橙幼苗进行转化。其中63株GFP阳性，46株油腺发育减少或缺失，17株油腺发育正常；另有2株GFP阴性幼苗也表现出油腺减少。选取4个独立植株进一步分析：1号株GFP阳性且无可见油腺；2号株GFP阳性但油腺发育正常；3号和4号株无GFP荧光且完全无油腺。PCR检测显示1–3号株含有nptII和GFP序列，4号株两者均未检出。基因分型确认1、3、4号株在CsLMI1位点编辑效率高，2号株仅27%。4号株表现出无油腺表型、CsLMI1被编辑且无可检测的GFP和卡那霉素抗性基因序列，被认定为推定无转基因基因组编辑植株。全基因组重测序未发现支持T-DNA区域或载体骨架整合的读段，但检测到部分野生型序列读段，表明该株为CsLMI1位点的遗传嵌合体。
五、讨论与结论
讨论部分指出，利用移液器吸头作为农杆菌接种、激素共培养和抗生素选择的局部腔室，提高了转化流程的可操作性和实用性。以琼脂糖替代MS盐作为低营养载体，能够在吸头内持续局部递送植物生长调节剂和抗生素，同时限制伤口部位微生物过度增殖。与此前研究中抗生素通过滴加或棉签擦拭间歇施用的方式相比，本研究的局部持续递送系统为转化和再生提供了更稳定的环境。幼苗年龄是影响转化效率的重要因素，10–15 d苗龄、5–7 cm株高为最优转化时期。细菌过度生长偶尔会严重抑制组织再生，未来可在选择培养基中添加Timentin等抗生素进一步抑制残留农杆菌生长。与已有原位转化方法相比，本系统在Carrizo枳橙、'Ziyang Xiangcheng'和金柑中的非嵌合转化效率显著提高，且成功覆盖全部6种测试基因型。'Shatian'柚和'Eureka'柠檬转化效率相对较低，可能源于基因型依赖的创伤再生能力、农杆菌敏感性、外源激素响应或抗生素耐受性差异。关于无转基因编辑植株的获得，本研究中利用CsLMI1无油腺表型作为早期形态学标记，从275株转化幼苗中恢复1株推定无转基因编辑植株，全基因组重测序未检测到T-DNA或载体骨架整合证据。尽管靶向扩增子测序显示CsLMI1编辑效率高达93%，但全基因组测序仍检测到野生型读段，表明该再生植株在CsLMI1位点为遗传嵌合体，然而整株表现一致的无油腺表型，说明残留野生型细胞或等位基因不足以恢复油腺发育。无转基因编辑植株的恢复频率相对较低仍是当前系统的局限，未来可结合ALS（乙酰乳酸合酶）共编辑和绿磺隆选择进一步提高无转基因编辑植株的恢复效率。
结论部分指出，本研究通过将传统组织培养中常用的激素处理与原位转化方法相结合，建立了一种快速且广泛适用的柑橘原位转化系统。3.0 mg/L 6-BA与0.05 mg/L NAA的优化组合在Carrizo枳橙中实现了13.92%的非嵌合转化效率。所有6种测试柑橘基因型均在播种后40 d内成功获得转基因植株，证明了该系统的广泛适用性和高效性。此外，优化平台支持CRISPR/Cas9介导的基因组编辑，约80%的分析转基因植株中检测到编辑事件，并成功获得推定无转基因的CsLMI1编辑植株。该方法为柑橘功能基因组学和基因组编辑提供了简单高效平台，在柑橘育种和遗传改良中具有潜在应用价值。
