猪鼻腔中双重抗原采样位点支持早期黏膜抗原摄取

《Veterinary Research》：Dual antigen-sampling sites support early mucosal antigen uptake in the porcine nasal cavity

　　

摘要 鼻内疫苗接种是预防呼吸道感染的一种有前景的策略。然而，猪鼻腔中介导抗原采样的解剖学和细胞学通路仍未完全阐明。本研究在猪鼻腔中鉴定并表征了两个空间上 distinct 的抗原采样位点：前部呼吸黏膜（respiratory mucosa, RM）和后部鼻咽相关淋巴组织（nasopharynx-associated lymphoid tissue, NALT）。鼻内给予卵清蛋白（ovalbumin, OVA）后，两个位点均有一亚群 OVA+ 上皮细胞被荆豆凝集素 I（Ulex europaeus agglutinin I, UEA-1）和 NKM 16-2-4 标记，提示这些细胞可能具有 M 细胞样表型。在 RM 中，OVA 最初定位于上皮层，随后在 6 h 时于固有层中检出，并在 24 h 时出现于 CD11c+ 细胞（可能包含树突状细胞的细胞群）中。相比之下，OVA 早在 2 h 即到达 NALT 下方的淋巴滤泡。6 h 时，下颌引流淋巴结中也检出了 OVA+ 细胞。此外，气-液界面共培养模型显示，OVA 可跨分化鼻上皮培养物进行顶端至基底外侧转运，并被其下方的分化骨髓细胞（differentiated bone marrow cells, dBMCs）摄取。综上，这些发现将前部 RM 和后部 NALT 鉴定为具有不同时间动力学的两个抗原采样位点，并定义了可能参与猪黏膜免疫诱导的早期细胞事件。

猪鼻腔双重抗原采样位点的早期黏膜免疫事件：研究解读

一、研究背景与科学问题

猪鼻腔黏膜是多种病毒和细菌病原体入侵的主要门户，包括猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流感病毒、伪狂犬病病毒、猪肺炎支原体、支气管败血波氏杆菌和多杀性巴氏杆菌等，这些病原体给养猪业造成了重大经济损失。鼻内免疫接种可在病原体暴露的初始部位诱导局部黏膜免疫应答，从而限制病原体入侵和感染，因此多项鼻内疫苗接种策略已在猪上进行了评估。然而，猪鼻腔中介导免疫诱导的细胞和解剖学机制仍不清楚。

黏膜免疫诱导位点是管腔抗原被采样并启动抗原特异性免疫应答的特化解剖区域，其标志性特征是存在抗原采样微褶（M）细胞。鼻咽相关淋巴组织（NALT）位于鼻腔后部，是已确立的鼻抗原诱导位点，其滤泡相关上皮（FAE）中的 M 细胞介导抗原摄取和转胞吞作用。然而，鼻腔 IgA 应答也可在缺乏 NALT 的情况下发生，提示可能存在其他解剖位点参与鼻免疫诱导。在小鼠中，前部鼻呼吸上皮中已鉴定出 distinct 的 M 细胞群，这些细胞表现出强抗原采样活性，可能提供了 NALT 之外的替代黏膜抗原摄取门户。然而，猪鼻腔中是否存在功能上类似的 M 样细胞和双重抗原采样位点此前尚不清楚。此外，虽然猪鼻腔呼吸黏膜中已鉴定出丰富的抗原呈递细胞（APCs），但这些细胞是否通过推定的 M 样上皮细胞获取管腔抗原仍不明确。

二、研究内容与主要结论

研究人员以卵清蛋白（OVA）作为模型蛋白抗原，系统比较了猪鼻腔前部呼吸黏膜（RM）和后部鼻咽相关淋巴组织（NALT）两个抗原采样位点，表征了具有 M 细胞样特征的 OVA 采样上皮细胞，评估了 OVA 向下方免疫细胞群的空间时间转移，并利用原代鼻上皮细胞与白细胞介素-4（IL-4）/粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）分化的骨髓细胞（dBMCs）共培养模型，验证了跨上皮抗原转运及免疫细胞对抗原的获取。研究鉴定出前部 RM 和后部 NALT 为两个空间 distinct 的抗原采样位点，二者具有不同的转运动力学：NALT 可快速将抗原递送至淋巴滤泡，而 RM 中抗原从上皮向固有层的转移则较为缓慢。这一发现揭示了猪鼻腔抗原采样的双位点架构，为优化猪鼻内疫苗递送策略提供了理论基础。

三、关键技术与方法

研究人员使用了多种关键技术手段。动物实验采用来自中国南京某商业农场的杜洛克×（长白×大白）杂交仔猪，7 日龄仔猪用于体内抗原采样表征，30 日龄仔猪用于细胞分离培养。主要技术包括：免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）检测组织切片中 OVA 分布；透射电镜（TEM）和扫描电镜（SEM）观察上皮细胞超微结构；多重免疫荧光结合酪胺信号放大（TSA）技术鉴定 OVA⁺ 细胞表型；流式细胞术定量分析抗原摄取细胞群；原代猪鼻上皮细胞气-液界面（ALI）分化培养模型；鼻上皮细胞与 dBMCs 共培养模型；单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据分析（数据来源于 GEO 数据库 GSE274334）；以及岩藻糖基化抑制实验。

四、研究结果

OVA 采样上皮细胞存在于前部 RM 和后部 NALT

7 日龄仔猪鼻内给予 OVA 后 2 h，前部呼吸黏膜和后部 NALT 的滤泡相关上皮中均检出 OVA⁺ 上皮细胞。按鼻腔五个解剖区域划分，OVA⁺ 细胞主要分布于 II-IV 区，以 II 和 III 区数量最多，鼻前庭（I 区）未检出，V 区仅局限于呼吸-嗅觉过渡带。年龄系列分析显示，新生仔猪 III 区未见 OVA 采样上皮细胞，而 7、10、30 日龄仔猪中均可检出。

OVA 采样上皮细胞具有 M 细胞样特征

OVA 与 KRT5、MUC5AC、OMP 或 α-微管蛋白之间未观察到可信的胞内共定位。而识别 α-(1,2)-岩藻糖修饰聚糖的 UEA-1 和 NKM 16-2-4 标记了 RM 和 NALT 中大量 OVA 采样细胞。鼻拭子来源细胞的流式分析进一步证实，部分 OVA⁺ 细胞为 UEA-1⁺。scRNA-seq 数据重分析未能解析出转录水平上 distinct 的猪 M 细胞亚群，常用 M 细胞标志基因未形成独立聚类。

RM 和 NALT 的组织学与超微结构特征

前部 RM 由假复层纤毛柱状上皮覆盖，而后部 NALT 上方上皮较薄且主要为非纤毛型。两个位点的 OVA⁺ 细胞均呈柱状形态并具有顶端微绒毛。透射电镜在两个位点均观察到具有不规则顶端微绒毛且与下方淋巴样细胞紧密相关的上皮细胞。扫描电镜在 RM 中鉴定出散在的具有短而不规则微绒毛的上皮细胞，NALT 表面许多上皮细胞缺乏纤毛并显示明显的顶端突起。

RM 和 NALT 呈现 distinct 的 OVA 分布动力学

OVA 给药后 2 和 4 h，OVA 主要定位于 RM 上皮内；6 h 时固有层中亦检出 OVA⁺ 细胞；24 h 时 OVA 信号主要见于固有层细胞。相比之下，NALT 中 OVA 早在 2 h 即已进入淋巴滤泡。共聚焦显微镜显示 24 h 时鼻固有层中 OVA 与 CD11c 信号共定位。流式分析在 6 和 24 h 时均于 RM 和 NALT 的 SWC3a⁺/SLA-DR⁺ 推定 APC 富集群中检出 OVA⁺ 细胞，两个时间点间频率无显著差异。此外，OVA 给药后 6 h 在下颌引流淋巴结中检出了 OVA⁺ 细胞。

分化鼻上皮培养支持 OVA 摄取和跨上皮转运

分化后的 ALI 培养原代猪鼻上皮细胞（ALI-NECs）形成假复层柱状上皮，包含纤毛细胞和杯状细胞，并显示连续的紧密连接蛋白 ZO-1 染色。OVA 信号常与 α-(1,2)-岩藻糖基化细胞共定位，而猪气管上皮细胞系（STEC）中未检出明显 OVA 摄取。OVA⁺/NKM 16-2-4⁺ 细胞频率数值上高于 OVA⁺/NKM 16-2-4^? 细胞，但差异无统计学意义。OVA 跨 ALI-NECs 的基底外侧转运随时间增加，12 h 时最高，期间跨上皮电阻（TEER）保持稳定。4 °C 条件下 OVA 转运显著减少，支持温度敏感的囊泡/跨细胞转运过程。2F-Fuc 抑制岩藻糖基化显著降低 ALI-NECs 的 OVA 摄取，且不影响细胞活力和屏障完整性。

岩藻糖基化抑制减少 OVA 向 dBMCs 的转移

在 ALI-NECs 与 CFSE 标记的 dBMCs 共培养体系中，顶端给予 OVA 后，上皮层下方检出 OVA⁺ dBMCs。2F-Fuc 预处理降低了 OVA⁺/UEA-1⁺ 上皮细胞频率，并减少了 SLA-DR⁺ dBMCs 对 OVA 的获取。

五、讨论与结论

讨论总结

RM 由假复层纤毛柱状上皮覆盖，限制大分子渗透，但散在分布的鼻 M 样细胞可能提供将管腔抗原递送至固有层抗原呈递细胞的特化门户。OVA 到达 NALT 淋巴滤泡仅需 2 h，而在 RM 中 2-4 h 仍主要局限于上皮，6 h 起才在固有层检出，这种差异可能反映了区域上皮结构和免疫细胞组织的不同。OVA⁺ 细胞在下颌引流淋巴结中被检出，但现有实验尚不能确定 OVA 是由迁移性鼻树突状细胞、其他白细胞还是以无细胞形式转运。体外实验中，α-(1,2)-岩藻糖基化⁺ 鼻 M 样细胞群被鉴定，2F-Fuc 抑制岩藻糖基化可减少 OVA 摄取，但由于 2F-Fuc 广泛抑制细胞岩藻糖基化而非选择性靶向 α-(1,2)-连接岩藻糖残基，尚不能确立 α-(1,2)-岩藻糖基化在 M 样细胞介导的抗原摄取中的直接因果作用。值得注意的是，相当比例的 OVA⁺ 细胞缺乏可检测的 α-(1,2)-岩藻糖基化，表明抗原采样不限于这一表型，α-(1,2)-岩藻糖基化可能不足以作为整个抗原采样群体的独立标志物。

研究结论

本研究将猪鼻腔前部 RM 和后部 NALT 鉴定为两个空间 distinct 的抗原采样位点。NALT 使抗原快速进入下方淋巴滤泡，而 RM 中的抗原跨上皮转移则较为渐进，涉及散在分布的鼻 M 样细胞和下方抗原呈递细胞。虽然 α-(1,2)-岩藻糖基化与抗原摄取相关，但其特异性不足以识别整个抗原采样群体。这些发现揭示了猪鼻腔抗原采样的双位点架构，可能支持黏膜免疫诱导的早期阶段，并为改善猪鼻内疫苗递送提供了基础。