《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：RPA-primed droplet-partitioned CRISPR/Cas12a assay for low-copy detection of Candida albicans in vaginal specimens
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白色念珠菌（Candida albicans）是外阴阴道念珠菌病的主要致病原因，在临床标本中灵敏检测低丰度真菌DNA仍具挑战。本研究开发了一种两阶段检测方法，将快速重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RP
白色念珠菌（Candida albicans）是外阴阴道念珠菌病的主要致病原因，在临床标本中灵敏检测低丰度真菌DNA仍具挑战。本研究开发了一种两阶段检测方法，将快速重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）与液滴分区CRISPR/Cas12a荧光检测相结合。靶DNA首先经RPA扩增10 min，随后在无需微流控芯片制备的条件下，通过涡旋产生多分散液滴进行分析。采用预设的基于无模板对照（NTC）的分析判定标准，在测试条件下，批量RPA-Cas12a检测的操作性检测限（LoD）为10拷贝/μL，液滴分区格式为1拷贝/μL。与所测试的非靶标微生物（包括其他临床相关的非白色念珠菌（non-albicans Candida）菌种）均未观察到交叉反应。在对28份残余阴道拭子标本的初步评估中，采用探索性队列衍生的液滴计数截断值，该检测方法与常规复合临床参考方法完全一致。由于比较方法并非针对白色念珠菌（C. albicans）的菌种特异性方法，这些发现代表初步一致性结果而非确切的诊断准确性。整个工作流程在约1 h内完成，且仅需基础实验室设备。这些发现表明，液滴分区可改善RPA-Cas12a检测的低拷贝数分析读数，并为阴道标本中白色念珠菌（C. albicans）DNA的定性鉴定提供了一种实用方法。
论文解读：基于RPA预扩增与液滴分区CRISPR/Cas12a的白色念珠菌低拷贝检测方法
一、研究背景与研究目的
外阴阴道念珠菌病（vulvovaginal candidiasis，VVC）是一种常见的真菌感染，影响全球大量女性，其中白色念珠菌（Candida albicans）是主要致病病原体。典型临床表现包括外阴瘙痒、红斑、肿胀、刺激感及异常阴道分泌物，反复或持续性感染可显著损害生活质量。因此，快速准确地检测白色念珠菌可为疑似VVC患者的评估提供有用的微生物学信息。然而，仅检测到白色念珠菌并不能确诊活动性VVC，因为无症状阴道定植也可能发生。
当前诊断念珠菌相关性阴道炎的实验室方法主要包括镜检、真菌培养及核酸扩增检测。培养法虽在临床实验室广泛使用，但相对耗时，在真菌载量较低时可能不利于快速决策。因此，临床仍需兼具高灵敏度、短周转时间和操作简便性的分子诊断策略。
CRISPR/Cas12a核酸检测平台具有可编程靶标识别能力和对单链DNA报告分子的反式切割活性，但传统批量CRISPR/Cas12a检测在低靶标浓度下灵敏度有限，且许多已报道的数字CRISPR平台依赖单分散微流控液滴和专用仪器，限制了其广泛应用。重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）是一种等温扩增技术，具有反应温度温和、扩增时间短、设备要求低等优点。将RPA与CRISPR/Cas12a整合可显著提高分析灵敏度。同时，将反应分区为液滴可在空间上限制Cas12a激活事件，抑制背景信号积累，改善信号判别能力。
RPA辅助CRISPR/Cas12a检测虽可在等温条件下快速扩增靶标，但最终荧光信号通常在批量反应中测量。在低靶标浓度下，由于靶标触发的报告分子切割与基础信号积累发生在同一反应体积中，批量荧光可能难以与背景区分。反应分区提供了一种在空间上限制Cas12a激活事件并改善低丰度靶标判别的手段。然而，RPA扩增后液滴分区的分析贡献需要与对应的批量RPA-Cas12a格式进行直接比较评估。
基于上述背景，研究人员开发了一种两阶段RPA-Cas12a检测方法，随后通过涡旋辅助多分散液滴分区进行白色念珠菌DNA检测。研究旨在确定：（i）快速RPA能否在10 min内提供足够的靶标扩增；（ii）与对应批量荧光检测相比，液滴分区能否改善低拷贝数检测；（iii）所建立的工作流程能否使用探索性队列衍生的阳性液滴截断值对阴道临床标本进行分类。研究人员系统优化了RPA和Cas12a反应条件，在扩增靶标背景下筛选crRNA，比较了批量与液滴两种格式的分析性能，并使用阴道分泌物标本进行了初步临床评估。
二、主要技术方法
研究人员采用了以下关键技术方法：以白色念珠菌ITS1–5.8S–ITS2区域为靶序列设计RPA引物和crRNA；采用两阶段检测流程，先进行RPA等温扩增（37°C，10 min），再将扩增产物引入CRISPR/Cas12a反应体系；通过涡旋乳化（2500 rpm，5 s）生成多分散液滴，无需微流控芯片制备；利用荧光显微镜成像和ImageJ软件进行阳性液滴自动计数；采用基于无模板对照（NTC）的预设分析判定标准确定操作性检测限（LoD）。临床评估使用了28份来自嘉兴大学第二附属医院的去标识残余阴道拭子标本，其中18份为复合参考阳性、10份为复合参考阴性。
三、研究结果
3.1 PddRPACas检测原理
PddRPACas检测策略为：靶标白色念珠菌DNA首先经RPA扩增，扩增产物随后引入Cas12a/crRNA/报告分子反应体系，并通过涡旋混匀与油相乳化生成多分散液滴。在含靶标扩增子的液滴中，序列特异性识别激活Cas12a反式切割活性，切割荧光报告分子产生局部荧光信号；不含靶标的液滴保持非荧光状态。荧光阳性液滴可在荧光显微镜下可视化。涡旋生成乳液的定量表征显示液滴直径约10至50 μm，超过90%的液滴小于30 μm，主要为小尺寸多分散反应隔室。该检测更适合解释为液滴分区荧光读数，而非严格的基于泊松分布的绝对定量平台。
3.2 RPA辅助Cas12a检测系统的可行性
研究人员首先建立了RPA辅助批量及液滴分区Cas12a检测的整体实验流程。筛选了靶向白色念珠菌ITS区域的RPA引物对，其中F1/R4引物对产生最强扩增条带，被选用于后续实验。随后在批量Cas12a荧光检测中评估了三个候选crRNA，crRNA2在RPA辅助反应条件下产生最强荧光响应且最快达到平台期，被选用于后续所有检测。将优化后的靶标识别系统转移至液滴分区格式后，与无模板对照相比，白色念珠菌组产生显著更高数量的荧光阳性液滴，验证了PddRPACas读数的可行性。
3.3 PddRPACas检测的优化
研究人员系统优化了影响检测性能的关键参数。RPA步骤中筛选了反应温度、引物浓度和Mg2?浓度，优化前RPA反应约需30 min接近饱和，优化后在约10 min内实现有效扩增。Cas12a步骤中优化了反应温度、Mg2?浓度、BSA浓度、Cas12a浓度及crRNA：Cas12a比例。优化条件下产生更强更快的荧光响应，转移至液滴格式后观察到更多荧光阳性液滴，证实了扩增和读数两个层面协调优化的益处。
3.4 PddRPACas检测的分析性能
使用含靶序列的质粒DNA进行系列稀释分析灵敏度评估。对于批量RPA-Cas12a荧光检测，每个浓度分析四个独立制备的技术重复反应，反应终点荧光超过NTC平均终点荧光加三个标准差即判定为阳性。在此标准下，10拷贝/μL是四个技术重复反应全部检出的最低靶标浓度，批量检测的操作性LoD为10拷贝/μL。对于液滴分区检测，每个浓度分析三个独立制备的技术重复反应，反应级阳性液滴计数超过NTC平均反应级计数加三个标准差即判定为阳性。在此标准下，1拷贝/μL是三个技术重复反应全部检出的最低浓度，液滴分区格式的操作性LoD为1拷贝/μL。两种读数格式的直接比较显示，最低可检出浓度从批量荧光格式的10拷贝/μL降至液滴分区格式的1拷贝/μL，分析可检测性改善约10倍。由于液滴为多分散且未进行泊松分析，该检测被解释为定性液滴分区读数而非绝对数字定量方法。
3.5 分析特异性与序列评估
研究人员将白色念珠菌基因组DNA与扩展的非靶标面板（包括都柏林念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、耳念珠菌以及铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌）进行检测。白色念珠菌组产生清晰的荧光阳性液滴信号，所有测试的非靶标生物均未超过分析阳性阈值。在混合念珠菌背景下白色念珠菌仍可检出。序列比对显示非靶标物种的RPA引物结合区和/或crRNA2结合区存在多个核苷酸错配，且相邻TTTC PAM在多个序列中不保守，为实验观察到的无交叉反应提供了序列基础。对11株白色念珠菌临床分离株的序列比对显示，F1引物结合位点、crRNA2前间隔区和R4引物结合位点内均无核苷酸替换，支持所选引物和crRNA结合位点在分析菌株中的保守性。
3.6 提取阴道DNA基质对PddRPACas检测的影响
研究人员使用一例复合参考阴性和qPCR阴性阴道标本的DNA提取物，在RPA步骤中替代等体积无核酸酶水，评估基质干扰效应。在20、100和500拷贝/μL三个靶标浓度下，白色念珠菌靶DNA在存在提取阴道DNA基质时均成功检出。各浓度下含基质反应组的阳性液滴计数较无基质对照组略有降低，但保持了清晰的浓度依赖性增加趋势。结果表明所测试的提取阴道DNA基质对RPA至Cas12a液滴检测流程产生适度抑制效应，但未阻止靶标检出。由于基质在DNA提取后获得且仅检测了一例阴性临床基质，这些发现应解释为提取后基质干扰评估，而非DNA提取回收率或阴道标本生物学多样性综合验证。
3.7 阴道拭子标本的初步临床一致性评估
研究人员分析了28份去标识残余阴道拭子标本，包括18份复合参考阳性和10份复合参考阴性。探索性分类截断值为53个阳性液滴，由10份复合参考阴性标本的阳性液滴计数均值加三个标准差得出（均值=17.8；SD=11.5）。使用该队列衍生截断值，所有18份复合参考阳性和所有10份复合参考阴性标本均被PddRPACas一致分类。相对于复合临床参考，阳性符合率（PPA）为100%（18/18；95% CI，81.5–100%），阴性符合率（NPA）为100%（10/10；95% CI，69.2–100%），总体一致性为100%（28/28；95% CI，87.7–100%）。由于复合临床参考并非针对白色念珠菌的菌种特异性方法，这些结果应解释为初步一致性而非确定的诊断灵敏度或特异度。
四、讨论与结论
讨论部分指出，使用探索性队列衍生的53个阳性液滴截断值，所有18份复合参考阳性和10份复合参考阴性标本均被一致分类，PPA、NPA和总体一致性均为100%。但这些数值不应被解释为菌种特异性诊断灵敏度或特异度，因为临床比较方法并非针对白色念珠菌特异性。阳性液滴计数的变异可能反映真菌载量、标本储存、DNA提取效率和基质相关抑制的差异。研究存在多项局限性：阳性截断值来自同一队列中的阴性标本，无独立验证队列；将RPA产物转移至Cas12a反应后再生成液滴存在扩增子污染风险；仅评估了一例参考阴性临床DNA基质，未包含提取前靶标加标；重复性评估基于同一实验批次内的技术重复反应，跨天、跨操作者、试剂批次和跨实验室重现性有待建立。此外，PddRPACas检测白色念珠菌DNA，无法区分症状性感染与无症状定植，阳性结果应结合临床表现和其他微生物学发现进行解释。
研究结论：本研究建立了RPA辅助液滴分区CRISPR/Cas12a检测方法，用于白色念珠菌DNA的低拷贝数检测。采用预设的基于NTC的分析阳性标准，在测试条件下批量RPA-Cas12a格式的操作性LoD为10拷贝/μL，液滴分区格式为1拷贝/μL。与所评估的非靶标生物（包括其他临床相关的非白色念珠菌菌种）均未观察到交叉反应。对28份残余阴道标本的初步检测显示与常规复合临床参考完全一致，但该比较方法并非针对白色念珠菌的菌种特异性方法，临床截断值来自同一小队列，且无独立验证人群。此外，检测白色念珠菌DNA无法区分活动性VVC与无症状定植。当前临床发现应解释为初步一致性数据。建立临床诊断性能之前，需要采用菌种特异性参考方法进行更大规模的独立研究，并进行更广泛的重现性测试、闭管整合和进一步基质评估。
