《Frontiers in Oncology》：The ZMAGE-A3 affitoxin 172-cpp has great potential for targeting therapy of tumors
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背景： MAGE-A3肿瘤抗原是癌-睾丸蛋白家族成员，在多种恶性肿瘤中显著过表达。亲和体分子是一类新型紧凑型靶向蛋白（约6.5 kDa），已被确立为用于分子成像和靶向癌症治疗的强效工具。本研究设计了一种新型亲和体分子，通过将MAGE-A3亲和体与修饰后的铜绿假
背景： MAGE-A3肿瘤抗原是癌-睾丸蛋白家族成员，在多种恶性肿瘤中显著过表达。亲和体分子是一类新型紧凑型靶向蛋白（约6.5 kDa），已被确立为用于分子成像和靶向癌症治疗的强效工具。本研究设计了一种新型亲和体分子，通过将MAGE-A3亲和体与修饰后的铜绿假单胞菌外毒素（PE38KDEL）及细胞穿膜肽（cpp）融合，开发出一种免疫毒素——ZMAGE-A3 affitoxin 172-cpp，并评估了其抗肿瘤效力。
方法： 研究人员通过SDS-PAGE验证了ZMAGE-A3 affitoxin 172-cpp的表达。采用qPCR筛选MAGE-A3阳性细胞。利用荧光成像检测ZMAGE-A3 affitoxin 172-cpp的内化情况。使用细胞计数试剂盒8（CCK-8）和集落形成实验检测细胞活力。通过流式细胞术测量细胞凋亡。采用近红外（NIR）成像分析ZMAGE-A3 affitoxin 172-cpp的体内靶向能力。
结果： ZMAGE-A3 affitoxin 172-cpp在活细胞中展现出对MAGE-A3蛋白的特异性结合。此外，DyLight755标记的ZMAGE-A3 affitoxin 172-cpp在注射后1小时即可观察到在MAGE-A3阳性肿瘤中的蓄积，并在48小时内被清除。ZMAGE-A3 affitoxin 172-cpp有效抑制了A375和A2058细胞的活力并诱导了凋亡。异种移植模型的结果表明，ZMAGE-A3 affitoxin 172-cpp有效抑制了体内肿瘤生长。
结论： 研究结果支持ZMAGE-A3 affitoxin 172-cpp作为MAGE-A3阳性癌症分子成像和治疗剂的潜力。
研究背景
黑色素瘤相关抗原A3（MAGE-A3）属于癌-睾丸抗原家族，在健康成人中仅特异性表达于睾丸，但在黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、结直肠癌、食管癌、多发性骨髓瘤和胃癌等多种恶性肿瘤中频繁过表达。这种在正常组织中的限制性表达和在肿瘤中的高免疫原性，使MAGE-A3成为癌症诊断和免疫治疗中极具吸引力的靶点。已有研究表明，使用CTLA-4检查点抑制剂可降低MAGE-A3 mRNA水平，而MAGE-A3的过表达与EGFR酪氨酸激酶抑制剂及化疗的耐药性相关。因此，开发靶向MAGE-A3的药物对于肿瘤成像和靶向治疗均具有重要意义。
单克隆抗体虽已成功应用于靶向癌症治疗，但其分子量较大（约150 kDa），限制了肿瘤穿透能力并导致血液清除缓慢，从而可能造成成像对比度欠佳。亲和体分子是源自葡萄球菌蛋白A B结构域的小型工程支架蛋白（约6.5 kDa）。它们对抗原具有高亲和力和特异性，同时具备低免疫原性、快速肾清除、优异的组织穿透性和高理化稳定性等优势。近年来，针对HER2、EGFR和HPV16/18 E7的亲和体已被开发用于分子成像和治疗。其中，靶向HER2的亲和体ZHER2:342已成功应用于乳腺癌临床成像。这些特性使亲和体分子成为体内分子成像和靶向治疗的有前景的候选者。
为了将亲和体的靶向能力转化为有效的治疗效果，可将毒素部分与亲和体偶联，生成“免疫毒素”。在本研究中，研究人员将MAGE-A3特异性亲和体（ZMAGE-A3 172）与修饰后的铜绿假单胞菌外毒素（PE38KDEL）以及一个细胞穿膜肽（cpp）融合。PE38KDEL毒素经过工程改造，可通过与内质网（ER）上的KDEL受体相互作用而滞留于内质网，从而通过ADP-核糖基化延伸因子2（EF2）增强其细胞毒性，进而诱导凋亡。cpp的引入有助于克服细胞膜的疏水屏障，促进细胞内化，有望增强免疫毒素的生物活性。截至目前，尚无靶向MAGE-A3的免疫毒素被报道。
主要关键技术方法
研究人员首先通过基因合成和原核表达系统在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并纯化了重组蛋白。采用qPCR筛选MAGE-A3阳性细胞系（人黑色素瘤细胞A375和人皮肤癌细胞A2058），并以MAGE-A3阴性的A431细胞作为对照。通过间接免疫荧光实验和共聚焦显微镜观察亲和体与天然MAGE-A3蛋白的结合与定位。利用CCK-8实验和集落形成实验评估细胞增殖抑制效果，采用流式细胞术检测细胞凋亡。在体内实验中，建立了A375和A2058异种移植裸鼠模型，使用近红外（NIR）荧光成像（DyLight755标记）评估肿瘤靶向能力，并通过尾静脉给药评估治疗效果。
研究结果
表达与鉴定： 研究人员通过SDS-PAGE鉴定到纯化的亲和体分子分子量约为7.5 kDa，Western blot实验证实ZMAGE-A3 172和免疫毒素融合蛋白能与抗His标签抗体特异性反应。
高度特异性的体外相互作用： qPCR和Western blot结果显示A375和A2058细胞中存在MAGE-A3 mRNA和蛋白。间接免疫荧光实验显示，只有MAGE-A3阳性的A375和A2058细胞在与ZMAGE-A3 172或ZMAGE-A3 affitoxin 172-cpp孵育后呈现红色荧光，荧光主要定位于细胞质和核周区域，而阴性对照A431细胞未见明显荧光，定量分析表明差异具有统计学意义。
体外靶向肿瘤细胞增殖： CCK-8实验和集落形成实验结果表明，ZMAGE-A3 affitoxin 172-cpp和ZMAGE-A3 172均能显著抑制A375和A2058细胞的活力和集落形成能力，其中ZMAGE-A3 affitoxin 172-cpp表现出更强的抗增殖能力。流式细胞术检测发现，与ZMAGE-A3 172相比，ZMAGE-A3 affitoxin 172-cpp能更显著地诱导细胞凋亡。
体内靶向与治疗效果： NIR光学成像显示，在A375和A2058两种异种移植模型中，DyLight755标记的ZMAGE-A3 affitoxin 172-cpp在注射后1小时即出现高对比度的肿瘤部位荧光信号，12小时达到峰值，并可维持至24小时。在治疗实验中，ZMAGE-A3 172显著抑制了A375和A2058肿瘤的体内生长，效果与抗MAGE-A3抗体相当。值得注意的是，ZMAGE-A3 affitoxin 172-cpp展现出了比ZMAGE-A3 172和抗MAGE-A3抗体更强的抗肿瘤能力。
讨论与结论
在讨论部分，研究人员指出，亲和体分子在分子成像领域相较于单克隆抗体具有多项显著优势，包括体积小带来的优越组织穿透能力和快速靶向肿瘤位点的能力，以及在尺寸和清除速率之间达到的理想平衡。ZMAGE-A3 affitoxin 172-cpp由载体部分MAGE-A3亲和体、毒素部分PE38KDEL以及cpp组成。PE38KDEL通过延长在内质网的驻留时间增强特异性和毒性，通过ADP-核糖基化EF2抑制蛋白质合成并启动凋亡。cpp的引入促进了细胞内化和毒素递送。体外细胞定位和体内成像实验验证了其增强的细胞内化能力和肿瘤靶向能力。研究人员还讨论了A375和A2058异种移植物在早期分布模式上的差异，可能归因于MAGE-A3表达水平、肿瘤血管通透性或间质压力的不同。关于脱靶特异性，A431细胞的阴性结果提示非特异性结合极小，但未来仍需更多阴性细胞系和正常组织进行验证。
结论部分翻译： 总而言之，研究人员成功设计了一种创新的免疫毒素——ZMAGE-A3 affitoxin 172-cpp，该分子对肿瘤细胞中的MAGE-A3具有高亲和力和特异性。该免疫毒素不仅能靶向MAGE-A3阳性肿瘤细胞，还能在体外和体内有效诱导恶性细胞死亡。这种靶向MAGE-A3的免疫毒素是一种极具前景的治疗药物，有望作为一种有效的肿瘤治疗方案得到应用。
