《Frontiers in Behavioral Neuroscience》：Effects of adolescent oxycodone exposure on adult remifentanil self-administration and gene expression in male and female mice
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引言： 阿片类药物危机是美国的一项公共卫生危机，预计2024年导致约54,000人死亡。处方止痛药（如羟考酮）及娱乐性使用是主要促成因素。青少年期使用止痛药可预测成年后转向更强效阿片类药物，但其因果关系及神经生物学机制尚未完全阐明。
方法： 研究人员将青春期雄性及雌性小鼠暴露于羟考酮（OXY）或生理盐水（SAL），随后在成年期测试其静脉自身给药（IVSA）强效合成阿片类药物瑞芬太尼的行为。对经青少年期OXY或SAL处理（伴或不伴后续IVSA）的成年小鼠，研究人员对奖赏相关脑区——伏隔核（NAc）和腹侧被盖区（VTA）——进行了RNA测序（RNA-seq）。
结果： 青少年期OXY暴露增加了雌性（而非雄性）小鼠成年期瑞芬太尼IVSA行为。与行为结果相反，青少年期OXY在成年期仅诱导了适度的差异基因表达，不过研究人员识别出若干值得未来研究的候选基因，尤其是在雄性NAc中。研究人员进一步发现，青少年期OXY在所有比较中均诱导了差异剪接，其中雌性VTA在IVSA后可能表现出更强的响应。基因集富集分析（GSEA）显示，青少年期OXY处理（对比SAL）在成年雄性NAc中产生基因集富集，且该富集模式在动物后续是否经历IVSA时相似。在雌性NAc中，仅OXY处理时的基因集富集极小，而IVSA队列则显示出显著富集。相反，青少年期OXY暴露单独与雄性和雌性VTA中相似的基因集富集模式相关，而该模式在IVSA队列中消失。互补的秩-秩超几何重叠（RRHO）分析识别出与GSEA结果一致的基因表达一致性模式。
讨论： 综合IVSA与RNA-seq结果，这些数据引出新假说：雄性小鼠在青少年期OXY暴露后，其NAc中产生基因表达响应，这与长期自主药物摄取行为不增加相关；而雌性小鼠在成年IVSA期间，其VTA中可能表现出与药物摄取增加相关的选择性剪接响应。这些分析为上述新假说的未来验证和机制研究提供了有价值的靶点。
论文解读
一、研究背景与科学问题
阿片类药物危机是美国严峻的公共卫生问题，从1999年到2004年，人均阿片类药物过量死亡率增长了约六倍，2024年估计导致约54,000人死亡。尽管芬太尼等强效非法合成阿片类药物目前是过量死亡的主要驱动因素，但羟考酮等止痛药仍是最常被滥用的阿片类药物。青少年是止痛药使用和滥用的重点关注人群，药物使用常在青春期因手术或运动损伤等事件后启动。虽然青少年符合阿片类药物使用障碍（OUD）标准的总体比例较低（1–2%），但青少年风险行为调查显示12%的青少年曾以非处方方式使用过阿片类药物。重要的是，青春期处方使用和滥用止痛药均可预测成年后滥用及转向更强效药物的行为，但其因果关系尚未完全阐明。
研究人员的研究核心假说认为，长期药物戒断相关的神经生物学变化反映了一种旨在恢复基线药物相关行为的稳态过程。大量文献支持滥用药物在奖赏相关脑区诱导神经元基因表达变化，其中许多变化仅在长期戒断期间出现，且涉及的基因不同于中毒和急性戒断所调控的基因。这些脑区包括腹侧被盖区（VTA）——外源性阿片类药物通过去抑制该区域增加中脑边缘奖赏系统的多巴胺释放，以及伏隔核（NAc）——VTA多巴胺投射的主要下游靶点和奖赏导向行为的关键调控者。尽管可卡因相关文献已很丰富，但阿片类药物诱导的基因表达研究仍较有限。已有研究报道青少年与成年啮齿动物对阿片类药物暴露的行为和转录组响应存在差异，但尚无研究使用下一代测序（NGS）表征青少年阿片类药物暴露的全基因组转录组响应。
为探究青少年阿片类药物暴露的长期效应，研究人员建立了模型：青少年小鼠通过皮下渗透微泵接受羟考酮28天（出生后第28–56天，PND 28–56），随后经历28天无药期（PND 56–84），该方案在文中称为"OXY"，生理盐水微泵对照称为"SAL"。研究人员此前报道，小鼠在青春期经历此OXY方案后吗啡条件性位置偏好（CPP）增加，但成年期经历则无此效应。他们还发现，成年期OXY在此时间点增加VTA中多巴胺信号相关基因的表达，而青少年期OXY则无此效应。这些数据引出假说：戒断诱导的稳态基因表达在青少年小鼠中受到干扰，从而促成OXY暴露的长期行为效应。本研究的主要目标之一是表征青少年OXY对芬太尼类似物瑞芬太尼静脉自身给药（IVSA）的影响——CPP模型药物奖赏，而IVSA模型自主药物摄取和药物强化，该设计是青少年期止痛药暴露后转向成年期自愿使用更强效阿片类药物的高度表面效度、转化相关模型。研究人员假设青少年OXY会增加雄性和雌性小鼠成年期瑞芬太尼IVSA。第二个主要目标是用RNA测序（RNA-seq）表征青少年OXY后NAc和VTA的全基因组基因表达变化，同时测序了经历瑞芬太尼IVSA的小鼠组织。鉴于已有报道先前药物暴露可改变大脑对再暴露的转录响应，研究人员假设青少年OXY会调节对瑞芬太尼IVSA的响应。
除差异基因表达分析外，研究人员还分析了OXY与SAL小鼠间的差异选择性剪接（AS）。可卡因已被充分证实可产生与差异表达基因截然不同的强健差异AS，但关于阿片类药物的AS研究很少，仅涉及阿片受体（Opr）基因的推定选择性剪接。
下一代测序是靶点发现的强大工具，研究人员此前已利用其识别药物暴露和戒断引起的差异表达或选择性剪接基因，并通过外源操控证明这些基因与药物奖赏和药物寻求有因果关系。然而，聚焦单基因的差异表达或剪接可能遗漏更广泛的生物学通路变化，因为单基因很少孤立地影响细胞功能。因此，除搜索OXY与SAL组间的个体差异表达基因（DEG）外，研究人员还利用多种无阈值生物信息学工具——基因集富集分析（GSEA）和秩-秩超几何重叠（RRHO）——来识别不同性别、时间点和脑区间的基因表达模式和生物学条目富集。
二、主要研究技术与方法
研究人员使用C57Bl/6NTac小鼠（B6；Taconic，纽约哈德逊），在宾夕法尼亚大学内部繁育。雄性及雌性后代在PND 21断奶，同性同窝小鼠群居饲养（每笼2–4只），实验期间自由获取食物和水，12小时光照周期。所有程序均经宾夕法尼亚大学动物护理与使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南。
在PND 28，所有小鼠皮下植入渗透微泵（型号1004；Alzet），平行于胸椎放置，以平均3 mg/kg/天剂量递送羟考酮盐酸盐（Spectrum Chemical）28天（PND 28–56），对照组仅递送生理盐水。该时间跨度几乎覆盖小鼠青春期发育的完整阶段，包括"早期"（PND21-33）、"中期"（PND 34–46）和"晚期"（PND 47–59）阶段。28天暴露后手术移除微泵，小鼠在家庭笼中经历28天无药期（PND56-84）达到成年。此时，小鼠进行IVSA测试或解剖用于RNA-seq。
IVSA实验中，部分经OXY或SAL处理的小鼠（初始n=12只/处理/性别）在微泵移除28天后开始瑞芬太尼IVSA。导管手术前一周将小鼠移至IVSA套间（反向光照周期的专用卫星饲养室）适应。首次IVSA会话前五天，植入内置颈静脉导管。术后恢复5天后，在暗周期进行IVSA测试。小鼠置于操作箱（Med Associates）中，每日2小时静脉瑞芬太尼（0.1 mg/kg/输注）自身给药会话，采用固定比率（FR）1方案，一次主动鼻孔戳触发一次输注，每次输注后20秒超时。每日会话限最多100次瑞芬太尼输注。瑞芬太尼是强效合成阿片类药物，代谢迅速，半衰期短（3–10分钟），促进操作学习并使小鼠能调整摄取量。六个FR1会话后，响应要求增至FR2四个会话，随后进行单次4小时渐进比率（PR）会话以评估动机。PR测试结束时，通过静脉注射氯胺酮测试导管通畅性，仅通畅小鼠纳入后续行为和RNA-seq分析。通畅小鼠次日完成一次额外FR2会话，随后立即处死和解剖（PND 96）。
RNA-seq组织采集自微泵移除后28天无药期后的小鼠亚组（OXY vs. SAL；n=8只/处理/性别），该时间点在测序结果中称为"OXY"。经历IVSA的小鼠在最终会话后立即处死（OXY+REMI vs. SAL+REMI），该时间点称为"IVSA"。小鼠颈椎脱臼处死后迅速取脑，在含蛋白酶抑制剂混合物的冰冷磷酸盐缓冲盐水中洗涤，用冠状组织基质制备1毫米伏隔核（NAc）和腹侧被盖区（VTA）切片，用2毫米（NAc）或1.5毫米（VTA）直径打孔器双侧显微解剖。组织立即在干冰上冷冻并储存于?80°C。
由于VTA打孔组织体积小，双侧1.5毫米VTA打孔样本合并（每样本2只小鼠）以增加RNA产量。双侧2毫米NAc打孔样本单独处理。样本按性别、时间点和脑区分批进行RNA提取和测序，每批每处理组（OXY vs. SAL）最终n=3–4个样本。对组织样本胞质部分提取RNA进行批量RNA-seq，先进行核质分离，Trizol法提取RNA。分离的RNA送至Azenta Life Sciences进行双端Illumina测序，先经Agilent TapeStation评估，Poly(A)选择文库制备后于Illumina NovaSeq（2×150 bp）测序，每样本约5000万（50M）读数。所有纳入最终分析的样本均通过Azenta Life Sciences内部质控，满足文库大小（≥4000万双端读数）和平均每碱基质量分数（≥Q35）阈值。使用bbduk函数修剪接头和低质量碱基。
测序结果根据样本处理批次分为八个数据集，每批包含单一性别（F或M）、时间点（OXY或IVSA）和脑区（NAc或VTA），每处理组n=3–4个样本。数据集命名为[性别-时间点-脑区]。修剪后的FASTQ文件使用kallisto伪比对至RefSeq注释（GCF_000001635.27）生成的转录组索引，所有样本伪比对比例超过85%阈值。abundance.tsv文件用tximport导入R，生成基因水平长度缩放计数估计，后续用DESeq2分析。保留在至少三个样本中长度缩放计数≥10的基因。差异表达分析前，用前500个最可变基因的VST转换表达进行主成分分析（PCA）、层次聚类和样本间相关性可视化。表现出异常表达谱的文库（n=1个F_IVSA_NAc，1个F_IVSA_VTA）从下游分析中排除。数据集内OXY与SAL处理间差异基因表达使用设计公式~treatment量化，可视化统计阈值为绝对log2倍数变化（FC）>0.25和FDR<0.2，定义为"候选基因"。
差异选择性剪接分析中，修剪后FASTQ文件用剪接感知比对器STAR比对至mm39基因组，使用GENCODE综合基因注释vM36，比对读数用rMATS v4.3.0处理以量化全基因组选择性剪接事件，使用JCEC输出文件。表达剪接连接定义为每数据集至少三个样本中总连接读数（包含和排除连接计数之和）≥10。差异剪接基因（DSG）定义为至少一个显著事件、dPSI>|0.1|且FDR<0.05的基因。
三、研究结果
3.1 青少年OXY仅升高雌性（而非雄性）小鼠成年固定比率瑞芬太尼摄取
所有组均表现出预期的主动与非主动鼻孔戳辨别。对每日主动鼻孔戳的三因素性别×处理×会话ANOVA显示处理主效应（p=0.013）。对每日瑞芬太尼输注的三因素ANOVA显示显著处理主效应（p=0.0118），以及显著的性别×处理交互（p=0.034）和性别×会话交互（p=0.028）。性别内事后两因素处理×会话ANOVA显示，雌性中处理对每日获得输注有显著主效应（p=0.006），雄性中则无（p=0.731）。FR1累积摄取的两因素ANOVA显示显著性别主效应（p=0.038）和处理主效应（p=0.020），交互呈趋势（p=0.057），事后?ídák多重比较检验显示雌性中处理对FR1累积摄取有显著效应（p=0.012），雄性中无（p=0.923）。FR2中处理主效应显著（p=0.042），性别×处理交互呈趋势（p=0.094）。PR测试显示总响应（p=0.019）和断点（p=0.019）存在性别主效应，雌性平均响应和断点高于雄性，但处理无显著主效应。这些数据表明，青少年OXY在低固定响应要求下升高雌性小鼠成年瑞芬太尼摄取，但不升高雄性，且不增加此PR方案下的动机。
3.2 青少年OXY在成年NAc和VTA诱导适度差异基因表达
PCA显示所有数据集中样本均未按处理聚类，提示显著的动物间生物学变异。DESeq2计算的差异基因表达在各数据集中均适度，经Benjamini-Hochberg多重比较校正（FDR）后存活的基因很少。雄性NAc候选基因（FDR<0.2）数量最多（M_OXY_NAc中54个，M_IVSA_NAc中12个）。F_OXY_NAc中识别出0个候选基因，F_IVSA_NAc中3个。VTA中，F_OXY_VTA中0个，F_IVSA_VTA中5个，M_OXY_VTA中1个，M_IVSA_VTA中12个。这些数据引出新假说：成年雄性NAc对青少年OXY的转录响应与相对SAL对照的瑞芬太尼摄取不增加相关。
各数据集间候选基因无重叠。M_OXY_NAc候选基因在任何其他数据集中log2FC极小；M_IVSA_NAc中log2FC为正的基因在M_OXY_NAc中也趋势向上，提示雄性NAc对青少年OXY的转录响应在有或无IVSA暴露时可能相似；这些基因在F_IVSA_NAc中趋势向下。VTA中观察到类似模式：M_IVSA_VTA候选基因在M_OXY_VTA中趋向同方向但幅度较小，而F_IVSA_VTA中识别的DEG在F_OXY_VTA中趋向相反方向。这引出另一新假说：先前青少年OXY的雄性和雌性在NAc中对IVSA的转录响应存在分歧。
M_OXY_NAc中许多候选基因具神经元性质，包括钾通道（Kcnj2, Kcnj5）、钙结合蛋白（Necab1, Calb1）、突触蛋白（Syt10, Lrrtm1, C1ql2, Sema5b, Slitrk6, Sytl4, Serinc2）、神经递质受体（Htr1b, Gabrq, Nmbr）、受体介导信号调控因子（Rgs2, Pde11a）、GABA转运体家族成员（Slc6a13）和即早基因（Egr4）。M_IVSA_NAc中候选基因包括调控兴奋性突触形成的突触蛋白神经元正五聚蛋白2（Nptx2）及其受体Nptxr、促肾上腺皮质激素释放激素相关肽Urocortin 1（Ucn）、髓鞘形成负调控因子Lingo1。M_IVSA_VTA候选基因包括经典即早基因Egr1、钙/钙调蛋白刺激环核苷酸磷酸二酯酶Pde1c、电压门控钙通道辅助亚基Cacna2d1。雌性中，F_IVSA_VTA一个值得注意的候选基因是Calbindin 1（Calb1；log2FC=0.334, FDR=0.091），一种已知调节NAc与VTA间多巴胺信号的钙缓冲蛋白，Calb1也在M_OXY_NAc中识别。
3.3 青少年OXY在成年NAc和VTA诱导差异选择性剪接
rMATS分析中，跳跃外显子（SE）事件比其他事件类型（保留内含子RI、互斥外显子MXE、选择性5'剪接位点A5SS、选择性3'剪接位点A3SS）更普遍。F_IVSA_VTA在所有事件类型中DSG数量最多，达387个，是任何其他数据集的两倍以上。rMATS识别的DSG与DESeq2识别的候选基因在任何数据集中均无重叠，与先前发现一致——滥用药物和其他刺激调控表达和选择性剪接的基因集不同。大多数DSG为单个数据集独有，数据集间共享较少。此分析引出新假说：青少年OXY后阿片类药物再暴露期间雌性VTA的差异剪接可能驱动观察到的瑞芬太尼IVSA增加。
F_IVSA_VTA中，脑源性神经营养因子（Bdnf）外显子2内选择性5'剪接位点使用增加（Bdnf 2C vs. 2B；dPSI=0.214, FDR=0.010），该位点已知影响mRNA树突定位。F_OXY_NAc和M_OXY_VTA均显示cAMP反应元件调节因子（Crem）差异剪接——cAMP信号下游转录响应的组分，受阿片类药物暴露和戒断调控，具有CREM和ICER两种蛋白亚型。F_OXY_NAc中CREM特异性外显子包含增加（dPSI=0.225, FDR=0.015），M_OXY_VTA中两种蛋白均含的外显子包含减少（dPSI=?0.156, FDR=0.034）。F_OXY_VTA和M_OXY_NAc均显示Neurexin-1（Nrxn1）差异剪接——对突触结构关键的蛋白，与自闭症和精神分裂症等疾病相关。F_OXY_VTA中Nrxn1外显子4包含增加（dPSI=0.268, FDR=0.050），M_OXY_NAc中外显子7选择性5'剪接位点使用减少（dPSI=?0.121, FDR=0.005），两者均为Nrxn1α亚型组分。
3.4 基因集富集分析揭示青少年OXY在成年NAc和VTA的相关条目富集
GSEA使用所有三个GO方面（分子功能MF、生物学过程BP、细胞组分CC），基因按DESeq2计算的带符号Wald统计量排序。尽管个体差异基因表达有限，所有数据集均显示一些显著条目富集（FDR<0.05），但富集条目数量存在显著差异。F_OXY_NAc（0个DEG）条目富集极少（0 MF, 1 BP, 9 CC）；F_IVSA_NAc（3个候选基因）显示大量条目富集（52 MF, 104 BP, 36 CC）；M_OXY_NAc（DEG最多）在NAc中富集GO条目最多（52 MF, 221 BP, 87 CC），随后是M_IVSA_NAc（39 MF, 206 BP, 57 CC）。VTA各数据集差异基因表达极少，但GSEA在OXY时间点显示雄性和雌性大量显著条目富集（F_OXY_VTA: 119 MF, 455 BP, 160 CC；M_OXY_VTA: 70 MF, 349 BP, 125 CC），IVSA时间点富集极有限（F_IVSA_VTA: 2 MF, 12 BP, 24 CC；M_IVSA_VTA: 6 MF, 3 BP, 6 CC）。
NAc中，M_OXY_NAc与M_IVSA_NAc间大量富集条目重叠，雄性与雌性间重叠少，条目包括离子跨膜转运体活性、突触翻译和细胞外组织相关条目；F_IVSA_NAc显示神经递质门控通道活性相关条目富集。少数男女共享GO条目（如核糖体结构组分和细胞骨架结构组分）富集方向相反（NES值相反）。VTA中，F_OXY_VTA与M_OXY_VTA重叠最多，条目包括电压门控离子通道活性、线粒体活性和能量合成，以及突触翻译相关条目；OXY与IVSA时间点间重叠极少。IVSA时间点富集有限，但显著条目倾向于与OXY时间点条目重叠，包括电压门控通道活性、电子传递链和突触翻译相关条目，共享条目NES方向在男女间一致但在OXY与IVSA时间点间反转。
CNET图显示显著富集由众多相关基因的小而方向一致的改变驱动。例如F_IVSA_NAc中，神经递质受体活性通过若干GABA受体亚基（Gabr）、甘氨酸受体亚基（Glra）和谷氨酸受体亚基（Gri）基因的小幅增加显著富集；M_OXY_NAc和M_IVSA_NAc中，众多钾通道亚基（Kcn）、钙通道亚基（Cacn）和溶质载体（Slc）基因小幅增加，促成离子通道和跨膜转运体通路富集。随机化对照GSEA（基因符号与Wald统计量顺序随机化）在每个数据集中均产生零个显著通路，为发现提供有效性支持。对DSG列表的GO过表达分析（ORA）和基于dPSI排名的无阈值GSEA均未在任何数据集中检测到条目富集。
3.5 秩-秩超几何重叠揭示NAc和VTA中青少年OXY转录响应的一致性
RRHO2分析中，NAc内M_OXY_NAc与M_IVSA_NAc间强一致性，与GSEA中这些数据集重叠且正相关的基因集富集一致。F_OXY_NAc与M_OXY_NAc一致性较弱。F_IVSA_NAc与F_OXY_NAc和M_IVSA_NAc均不一致，与雄性和雌性NAc在青少年OXY后瑞芬太尼IVSA响应中基因集富集方向相反的观察一致。VTA中，F_OXY_VTA与M_OXY_VTA间强一致性，与这些数据集大量GSEA重叠一致。F_IVSA_VTA与M_IVSA_VTA正一致性较弱。F_OXY_VTA与F_IVSA_VTA中度不一致，M_OXY_VTA与M_IVSA_VTA轻度一致。RRHO2计算的基因重叠优势比热图在所有情况下与超几何热图模式一致，支持发现不受纳入所有重叠表达基因（每数据集约17,000–18,000个基因）的影响。随机化对照分析（基因符号与排序统计量打乱）在所有情况下消除了原始分析中的一致性模式，支持结果不太可能是由于所有RNA均来自脑组织而产生的假阳性。
对两个一致性最强的比较（M_OXY_NAc vs. M_IVSA_NAc和F_OXY_VTA vs. M_OXY_VTA），提取上-上和下-下象限最显著热点的贡献基因进行GO ORA。M_OXY_NAc vs. M_IVSA_NAc的上-上重叠基因富集突触相关条目，下-下重叠基因富集翻译相关条目；F_OXY_VTA vs. M_OXY_VTA的上-上重叠基因富集突触和离子通道相关条目，下-下重叠基因富集线粒体和翻译相关条目。
四、讨论与结论
综合IVSA和RNA-seq数据，研究人员提出新假说：雄性小鼠在青少年OXY暴露后NAc中产生基因表达响应，这与长期自主药物摄取不增加相关；而雌性小鼠在成年IVSA期间VTA中可能表现出与药物摄取增加相关的选择性剪接响应。具体而言，雌性中青少年OXY增加成年瑞芬太尼IVSA，但差异基因表达有限，而F_IVSA_VTA显示最大数量DSG（387个），提示雌性VTA在阿片类药物再暴露期间的差异剪接可能与增加的药物摄取相关。雄性中，M_OXY_NAc显示最多候选基因和GSEA条目富集，且M_OXY_NAc与M_IVSA_NAc间RRHO强一致，提示雄性NAc对青少年OXY的转录响应与IVSA后相似，可能与该行为不增加相关。
这些分析为未来验证和机制研究提供了有价值的靶点，包括M_OXY_NAc中的钾通道（Kcnj2, Kcnj5）、钙结合蛋白（Necab1, Calb1）、突触蛋白（Syt10, Lrrtm1, C1ql2, Sema5b, Slitrk6, Sytl4, Serinc2）、神经递质受体（Htr1b, Gabrq, Nmbr）等，M_IVSA_NAc中的Nptx2、Nptxr、Ucn、Lingo1，M_IVSA_VTA中的Egr1、Pde1c、Cacna2d1，F_IVSA_VTA中的Calb1，以及差异剪接事件中的Bdnf、Crem和Nrxn1。这些候选基因需进一步验证以阐明其在青少年OXY后自主药物摄取调控中的因果作用，但均为未来研究提供了有吸引力的靶点。
