基于多重交叉置换扩增(MCDA)-CRISPR/Cas12a技术的氨基糖苷类耐药16S rRNA甲基化酶基因armA高灵敏高特异性检测

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Highly sensitive and specific detection of aminoglycoside resistance methylase gene armA by multiple cross displacement amplification-CRISPR/Cas12a technique

引言：16S rRNA甲基化酶armA是介导细菌病原体对氨基糖苷类抗生素高水平耐药的关键分子决定因素。建立一种快速且可靠的armA基因检测方法，将有助于产酶菌株的监测，并支持在不同生态场景中的耐药控制。方法：研究人员建立了一种多重交叉置换扩增（multiple cross displacement amplification, MCDA）联合CRISPR/Cas12a系统的检测方法，以实现对armA基因的快速、特异且灵敏的鉴定。结果：整个实验流程，包括基因组DNA提取（15分钟）、MCDA反应（40分钟）、CRISPR/Cas12a介导的切割（5分钟）和荧光检测（10分钟），可在70分钟内完成。在分析特异性方面，该检测对所有armA阳性分离株均呈阳性结果，对所有非armA样本均呈阴性结果。MCDA-CRISPR/Cas12a检测的灵敏度达到低至10 copies/mL的armA阳性质粒DNA。在经全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）验证的129株临床培养分离株中，该检测对armA的检出与测序结果的一致性达到100%。讨论：本研究建立的技术为临床和畜牧环境中armA的实验室监测提供了一种快速、准确的诊断手段，并在进一步简化和验证后具有用于即时检测（point-of-care）的潜力。

氨基糖苷类抗生素广泛用于革兰阴性菌感染的治疗，但耐药性问题日益突出，尤其是16S rRNA甲基化酶通过修饰16S rRNA而阻碍氨基糖苷类药物与30S核糖体亚基结合，从而介导高水平耐药。armA基因是肠杆菌科中最常见的16S rRNA甲基化酶基因，已在多种临床重要革兰阴性菌中广泛播散。现有检测方法如基于GeXP分析仪的多重PCR和靶向液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）等耗时长、受检测条件限制，难以满足快速检测需求。因此，建立快速、灵敏且特异的armA基因检测技术对耐药监测和抗生素合理使用具有重要意义。

针对上述问题，研究人员将多重交叉置换扩增（multiple cross displacement amplification, MCDA）与CRISPR/Cas12a系统结合，建立了armA基因的MCDA-CRISPR/Cas12a检测方法。MCDA利用10条引物识别靶序列的10个区域，在恒温条件下进行预扩增；CRISPR/Cas12a系统识别含前间隔序列邻近基序（protospacer adjacent motif, PAM）的扩增产物后，激活非特异性反式切割活性，切割荧光标记的单链DNA（single-stranded DNA, ssDNA）报告探针，通过荧光信号判读结果。该技术可在70分钟内完成包括DNA提取、MCDA反应、Cas12a切割和荧光检测在内的全过程。用于评估的样本包括22株armA阳性分离株、24株携带其他耐药基因的阴性分离株及rmtA质粒，并以2018—2024年武汉8家医院收集的129株经全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）验证的产碳青霉烯酶革兰阴性菌进行临床验证。

研究结果如下：

MCDA-CRISPR/Cas12a技术的验证：以armA阳性质粒DNA为模板，在63°C进行MCDA预扩增后，琼脂糖凝胶电泳、显色指示和CRISPR/Cas12a荧光检测三种监测方法结果一致，阴性和空白对照均无信号；armA序列比对显示引物和crRNA靶区域在不同菌种间保守，证明该方法可行且可靠。

MCDA-CRISPR/Cas12a检测的最适反应条件：在60–67°C范围内比较MCDA扩增效率，61–67°C均为适宜温度，因此选择63°C作为最佳反应温度。

MCDA-CRISPR/Cas12a技术的灵敏度与特异性评估：采用armA阳性质粒DNA梯度稀释评估检测限（limit of detection, LoD），MCDA-CRISPR/Cas12a的检测限为10 copies/μL；Probit回归分析得到95%检测限为7.2 copies/μL（95%置信区间：5.8–9.5 copies/μL），在LoD浓度下重复7次实验的批内变异系数（coefficient of variation, CV）为21.99%，信噪比（signal-to-noise ratio, SNR）为72.83。特异性检测中，22株armA阳性菌均呈阳性，24株携带其他耐药基因的菌株及rmtA质粒均呈阴性；BLAST分析显示该体系与其他16S rRNA甲基化酶基因无明显同源相似性，说明其特异性高。

临床样本验证：对2018—2024年武汉8家医院收集的129株产碳青霉烯酶革兰阴性菌进行检测，以全基因组测序为金标准，该法准确鉴定出21株armA阳性菌和108株armA阴性菌，与测序结果100%一致。

与其他armA检测技术的比较：常规PCR检测限为1.05×10³ copies/μL，新方法为10 copies/μL，灵敏度提高100倍；与文献报道的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）（10² copies，特异性100%）、GeXP多重PCR（10 copies，特异性85.71%）、LC-MS/MS（特异性99.49%）、免疫层析（12 ng armA蛋白，约10⁶–10⁸ copies）等方法相比，该方法在灵敏度或特异性上具有优势。

讨论与结论：讨论部分指出，MCDA相比LAMP和重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification, RPA）在引物识别区域数量和反应体系简化方面具有优势；荧光检测比显色指示和凝胶电泳更适合低浓度靶标。由于未经处理的临床标本中armA丰度较低，对培养分离菌株直接检测耐药基因更符合实际工作流程。该方法的检测限与已报道的MCDA-CRISPR以及LAMP-CRISPR/Cas12a（ermB）、RPA-CRISPR/Cas13a（blaKPC、blaNDM）等方法相当。目前该方法更适合在参考实验室或中心化临床微生物实验室使用，尚不能直接作为即时检测（point-of-care testing, POCT）工具，主要受限于荧光检测设备、手工DNA提取以及对冷链试剂的需求；未来可通过集成微流控和冻干试剂加以改进。结论：研究人员开发了一种简单、快速且准确的armA基因MCDA-CRISPR/Cas12a检测方法，检测限为10 copies/μL armA阳性质粒DNA，特异性为100%，性能可靠，有望在实际监测中显著提高靶基因的检出效率。