《Frontiers in Immunology》：Multi-omics integration identifies serum FTL as a novel diagnostic biomarker for esophageal squamous cell carcinoma
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背景： 食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）是中国常见的恶性肿瘤，由于缺乏有效的早期诊断方法，其五年生存率较低。本研究旨在识别潜在的无创生物标志物并阐明其潜在机制。
方法： 研究人员采
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背景： 食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）是中国常见的恶性肿瘤，由于缺乏有效的早期诊断方法，其五年生存率较低。本研究旨在识别潜在的无创生物标志物并阐明其潜在机制。
方法： 研究人员采用整合策略，结合血清蛋白质组学分析、批量RNA测序（bulk RNA sequencing）和单细胞RNA测序（single-cell RNA-seq, scRNA-seq）分析。对15例未经治疗的早期ESCC患者和5例健康对照者的血清样本进行定量蛋白质组学分析。将差异表达蛋白（differentially expressed proteins, DEPs）与GSE53624数据集中的差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）进行交叉比对，并采用LASSO回归构建诊断模型。利用scRNA-seq数据进行交叉验证。采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）在两个中心的155份血清样本中验证FTL。使用scTenifoldKnk进行计算机模拟FTL敲除，随后进行基因本体论（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）和蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析。
结果： 蛋白质组学分析共鉴定出129个DEPs。与GSE53624 DEGs取交集后获得8个重叠基因，并构建了包含6个生物标志物（TF、CHAD、CSRP1、FCGR3A、RCN1、FTL）的诊断模型，在验证队列中AUC为0.882–1.0。scRNA-seq交集分析确定FTL为唯一重叠的DEG，在ESCC上皮细胞和巨噬细胞中高表达。FTL表现出强大的独立诊断性能，在三个GEO数据集中的AUC值范围为0.872至0.970。ELISA验证在早期ESCC中AUC为0.75（95% CI: 0.674–0.816）和0.838（95% CI: 0.751–0.905），优于CEA和SCCA。FTL与SCCA联合进一步增强了鉴别效能。机制上，FTL与免疫细胞浸润改变相关，其特征为静息树突状细胞和M2巨噬细胞增加、滤泡辅助性T细胞减少，以及铁死亡（ferroptosis）通路激活。计算机模拟FTL敲除揭示DEGs富集于应激和代谢生物学过程、细胞外囊泡（细胞组分）、转录调控（分子功能，CHOP-ATF3复合物）、IL-17/TNF通路以及脂质/活性氧（ROS）相关通路。蛋白质-蛋白质相互作用枢纽包括FOS、ATF3、NFKBIA和CXCL8，FTL与NFE2L2、TFRC和TXNRD1相关联。
结论： FTL是ESCC可靠的无创血清诊断生物标志物。计算分析表明其是需要进一步机制和治疗研究的候选分子。
论文解读
一、研究背景与科学问题
食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）是中国常见的恶性肿瘤，由于缺乏有效的早期诊断靶向手段，ESCC患者的五年生存率仍然很低，这凸显了开发新型预防和治疗策略的迫切性。血清蛋白生物标志物具有优异的稳定性、检测简便性和成本效益，其无创特性便于对治疗疗效和患者预后进行纵向监测，因此血清蛋白是临床实践中最为理想且应用最广泛的肿瘤标志物类别之一。近年来蛋白质组学技术的快速发展极大地促进了大量潜在蛋白标志物的发现，然而蛋白质组学筛选结果的验证仍面临诸多挑战，尤其是候选蛋白数量庞大，如何精准选择失调蛋白进行后续实验验证成为生物标志物研究的关键环节。
多组学方法已彻底改变了临床意义生物标志物的识别，并为疾病异质性和进展提供了前所未有的见解。然而，整合蛋白质组学与单细胞组学策略用于生物标志物发现的研究仍然稀缺。蛋白质组学提供了驱动表型变化的功能分子的直接读数，由于转录后调控、表观遗传修饰和翻译后修饰的存在，蛋白质的丰度和活性往往与mRNA水平的一致性有限，因此蛋白质组学是转录组学不可或缺的补充。研究团队此前的蛋白质组学分析仅采用简单的差异分析和基于倍数变化及p值的候选筛选，大量差异表达基因使得个体验证不切实际，仅FGL1被验证在ESCC筛查中有应用价值。为克服这一局限并更好地利用大规模组学数据，本研究整合了蛋白质组学、批量RNA测序和单细胞RNA测序（scRNA-seq），系统描绘关键候选生物标志物的表达模式。
二、研究设计与核心发现
本研究在中山大学肿瘤防治中心（SYSUCC）收集了15例早期ESCC患者和5例健康供者的血清样本进行定量蛋白质组学分析，共定量1243种蛋白质，最终鉴定出710种具有完整定量信息的血清蛋白。经Student's t检验比较，早期ESCC组与健康对照组间有129个蛋白质（DEPs）表达存在显著差异，其中71个上调、58个下调。将GSE53624数据集的3415个DEGs（1408个上调、2007个下调）与血清蛋白质组DEPs取交集，获得5个上调基因和3个下调基因。通过LASSO回归筛选出6个生物标志物（TF、CHAD、CSRP1、FCGR3A、RCN1、FTL），构建了基于组织的转录组诊断模型（Risk Score=0.012185×TF?2.050285×RCN1?2.502206×FTL?2.004767×FCGR3A+3.651123×CSRP1+2.783106×CHAD），在GSE53624训练子集中AUC为1.0，内部验证子集中为0.992；在独立外部验证数据集GSE23400、GSE20347和TCGA-ESCC中AUC分别为0.972、0.934和0.882。
将已建立模型的6个生物标志物与ESCC单细胞转录组中食管癌与正常上皮细胞的差异表达基因进行交集分析，仅鉴定出一个差异表达基因FTL。该基因在上皮细胞和巨噬细胞中高表达，且在正常与肿瘤上皮细胞间存在显著表达差异。FTL在GSE53624（AUC=0.970）、GSE23400（AUC=0.872）和GSE20347（AUC=0.947）三个GEO数据集中均表现出良好的独立诊断效能。利用来自两个独立中心（潮州市人民医院CZPH和中山大学肿瘤防治中心SYSUCC）的血清样本进行ELISA验证，结果显示ESCC患者血清FTL浓度显著高于正常对照（P<0.001），总体人群AUC为0.75（95% CI: 0.674~0.816），早期ESCC为0.838（95% CI: 0.751~0.905），优于传统血清标志物CEA和SCCA。在所有患者中，FTL与SCCA联合的Panel 2诊断性能显著优于FTL单独使用及其他所有单一传统标志物；但在早期ESCC中，Panel 2与FTL单独使用的AUC相当（0.824 vs. 0.838），差异无统计学意义（p=0.6694）。
三、关键技术方法
研究人员采用了以下主要技术方法：第一，定量蛋白质组学分析，对SYSUCC收集的15例早期ESCC患者和5例健康对照血清样本进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析；第二，批量RNA测序数据分析，从TCGA和GEO数据库（GSE53624、GSE23400、GSE20347）获取ESCC基因表达数据，使用limma和DESeq2包进行差异表达分析；第三，单细胞RNA测序分析，对GSE196756数据集（6个样本：3例ESCC、3例正常）进行质量控制、标准化、降维聚类和细胞注释；第四，LASSO逻辑回归模型构建，通过glmnet包实现，采用10折交叉验证选择最优惩罚参数λ；第五，酶联免疫吸附试验（ELISA），使用Human FTL ELISA Kit在两个中心（SYSUCC和CZPH）的155份血清样本中验证FTL浓度；第六，CIBERSORT算法评估22种免疫细胞亚群的浸润水平；第七，scTenifoldKnk进行计算机模拟FTL敲除，随后进行GO、KEGG和STRING数据库PPI网络分析。
四、研究结果详解
血清蛋白质组与批量RNA-seq的整合分析： 通过比较早期ESCC患者与健康对照的血清蛋白质组，鉴定出129个DEPs（71个上调、58个下调），与GSE53624数据集的DEGs交集后获得8个重叠基因（5个上调、3个下调）。
模型构建与评估： 基于LASSO回归筛选的6个生物标志物构建诊断模型，在训练集和内部验证集中AUC分别达1.0和0.992，在三个独立外部验证数据集中AUC为0.882–0.972，显示出优异的诊断性能。
血清蛋白模型与单细胞转录组的交集分析： 将6个模型生物标志物与scRNA-seq上皮细胞差异表达基因取交集，仅FTL为共同差异表达基因，在ESCC上皮细胞和巨噬细胞中高表达。
FTL作为ESCC潜在生物标志物： FTL在三个GEO数据集中AUC为0.872–0.970；血清ELISA验证显示FTL在总体人群和早期ESCC中AUC分别为0.75和0.838，优于CEA和SCCA；FTL与SCCA联合的Panel 2在总体人群中进一步提升了诊断效能。
FTL表达与ESCC免疫细胞浸润的相关性： 基于GSE53624数据集，高FTL表达组表现为静息树突状细胞和M2型巨噬细胞浸润增加、滤泡辅助性T细胞（Tfh）浸润减少；Pearson相关分析显示FTL表达与Tfh细胞负相关（R=?0.348, p<0.001）、与静息树突状细胞正相关（R=0.281, p=0.002），与M2巨噬细胞无显著线性相关（R=0.145, p=0.116）。
FTL表达与铁死亡通路活性的关联： 在批量RNA-seq和scRNA-seq两个独立基因集中，高FTL表达组的铁死亡驱动基因和抑制基因表达水平均显著高于低FTL表达组，且抑制基因的通路活性评分显著高于驱动基因，提示FTL可能主要通过上调铁死亡抑制基因参与ESCC中铁死亡的调控。
FTL虚拟敲除后的差异调控基因及功能特征： 使用scTenifoldKnk进行五次独立计算机模拟FTL敲除，合并DEGs的GO富集显示应激和代谢反应相关生物学过程、细胞外囊泡（细胞组分）和转录调控（分子功能，CHOP-ATF3复合物）显著富集；KEGG分析显示IL-17、TNF、NF-κB、凋亡等炎症/免疫通路以及脂质/动脉粥样硬化和ROS相关通路富集；PPI网络分析鉴定出FOS、ATF3、NFKBIA和CXCL8为高连接度枢纽基因，FTL与NFE2L2、TFRC和TXNRD1紧密关联，其中TFRC和TXNRD1将网络连接至铁代谢和氧化应激。
五、讨论与结论总结
讨论部分指出，本研究通过多组学整合策略鉴定了早期ESCC的诊断生物标志物并探索了其功能。FTL作为铁储存蛋白复合物的关键亚基，在维持铁稳态和抗氧化防御中发挥核心作用，已在多种恶性肿瘤中异常表达并参与肿瘤发生发展。本研究发现FTL在上皮细胞和巨噬细胞中高表达，高FTL水平与静息树突状细胞和M2巨噬细胞增加、Tfh细胞减少相关，提示免疫抑制性肿瘤微环境特征。FTL与铁死亡通路活性的关联提示其可能通过上调抑制基因来抑制ESCC细胞的铁死亡。计算机模拟敲除分析预测FTL可能作为炎症激活、氧化应激和转录重编程的上游调节因子，通过IL-17、TNF和NF-κB等促炎信号通路发挥作用，并与TFRC、TXNRD1和NFE2L2的相互作用将FTL置于铁代谢、活性氧调控和炎症信号的三联轴心。
研究结论为：多组学分析确定FTL是早期ESCC可靠且独立的诊断生物标志物，其性能优于传统血清标志物。相关多组学和计算分析提示FTL可能通过与肿瘤微环境、铁死亡和炎症信号通路的潜在串扰参与ESCC进展。这些机制观察仅来源于计算机模拟预测和转录组水平关联，FTL是需要进一步实验功能验证的候选分子，在考虑作为治疗靶点之前仍需深入研究。
研究也存在局限性：针对FTL的高特异性抗体-抗原对有限；尚无标准化和临床验证的商业检测试剂盒；血清FTL的分子形式尚未完全阐明，循环FTL以游离轻链、铁蛋白异聚体、糖基化异构体和铁结合复合物的异质混合物形式存在；循环FTL受铁代谢状态、全身炎症、肝功能、年龄和性别等多种临床混杂因素影响。未来需要开发稳健的免疫检测方法、表征循环FTL种类、控制临床协变量，并在大型多中心队列中验证其临床实用性。
