烟草-大麦轮作重塑土壤微生物群落并富集具有促生潜力的可培养细菌

《Frontiers in Plant Science》：Tobacco–barley rotation reshapes soil microbial communities and enriches culturable bacteria with plant growth-promoting potential

　　

： 引言：作物轮作是缓解烟草连作障碍的重要农艺措施，然而前茬禾本科作物对植烟土壤微生物群落及其潜在功能的影响尚未得到系统验证。 方法：基于三年连续田间试验，本研究以烤烟-休闲系统（CK）为对照，建立烤烟-大麦轮作系统（DM）。整合土壤化学性质与酶活性测定、细菌16S rRNA与真菌ITS扩增子测序、可培养细菌分离以及温室盆栽回接试验，评估大麦轮作后土壤环境与微生物群落的变化，并验证候选富集菌株的植物促生潜力。 结果：与CK相比，DM显著（P < 0.05）提高了土壤溶解性有机碳（DOC）、速效磷（AP）、速效钾（AK）和碱解氮（HN），增幅分别为19.65%、3.23%、5.45%和5.90%；蔗糖酶、β-葡萄糖苷酶、酸性磷酸酶和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性分别提高23.80%、66.28%、15.23%和176.32%。扩增子测序表明，大麦轮作显著改变了土壤细菌和真菌群落。鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和伯克霍尔德菌-卡巴勒罗尼亚菌-副伯克霍尔德菌（Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia）在DM下相对富集，并与多项土壤养分和酶活性变量显著相关，因此被定义为候选富集细菌类群。随后从DM土壤中获得属于这些类群的6株可培养分离菌。体外试验中，这些菌株表现出不同的功能表型组合，包括在无氮培养基上生长、磷转化、钾溶解、锌溶解、铁载体产生以及有机底物降解。温室盆栽试验表明，混合接种显著促进了烤烟生长，并增加了植株氮、磷、钾累积量。 结论：大麦轮作伴随土壤速效养分、酶活性和微生物群落组成的显著变化，而从轮作富集类群中获得的可培养菌株在受控条件下表现出植物促生潜力。这些发现支持轮作富集微生物参与后续植物-土壤养分反馈的可能性，但其在田间轮作效应中的直接介导作用仍需进一步验证。本研究为理解大麦-烟草轮作的微生物生态效应及筛选潜在植物促生细菌提供了理论依据和候选微生物资源。

论文解读

一、研究背景与问题

烤烟（Nicotiana tabacum L.）是我国西南地区重要的经济作物，但对连作高度敏感。长期连作会导致根际酚类等化感物质积累，破坏植物膜系统、光合作用及相关酶活性，从而抑制植株生长并降低烟叶产量与品质。同时，连作会加剧土壤养分耗竭与质量退化，促进潜在病原微生物积累，扰乱微生物群落结构，加重土传病害。已有研究表明，长期连作显著降低烤烟产量，并伴随土壤速效氮、磷、钾和有机质含量下降。在微生物层面，连作通常表现为细菌多样性降低、有益微生物减少以及镰孢菌属（Fusarium）等潜在病原真菌富集。因此，通过合理的种植制度恢复根际微生态功能，是缓解烟草连作障碍、维持植烟土壤生产力的重要科学问题。

作物轮作是缓解连作障碍和改善土壤健康的重要农艺措施。不同前茬作物产生的土壤遗留效应具有强烈的物种特异性，例如豆科作物主要通过根瘤菌共生固氮增加土壤氮输入，而油菜和小麦等作物则通过根系分泌物和残体质量的差异改变土壤养分循环及相关微生物类群。在烟草轮作体系中，已有研究证实豆科和葱属等前茬作物可通过调节土壤结构、养分状况和微生物群落促进后茬烤烟生长。然而，现有研究多聚焦于轮作是否改善土壤性质和作物生长的结果导向评估，对于不同前茬作物形成的特异性微生物遗留效应，尤其是哪些核心功能微生物类群实际参与后茬烤烟的生长与养分获取，仍认识不足。

大麦（Hordeum vulgare L.）作为禾本科作物，与烟草在分类学、根系资源利用策略和病原宿主范围上差异显著。大麦根系可释放糖类等易利用碳源，生长季根系活动和残体还田可改变土壤有机底物组成，从而对根际微生物产生选择性压力。此外，禾本科与茄科之间系统发育距离较远的轮作有助于中断某些偏好宿主的病原体持续增殖。因此，大麦作为前茬作物可能通过“根际碳输入-环境过滤-微生物群落重组”过程，形成区别于豆科及其他轮作作物的土壤微生物遗留效应。

土壤微生物遗留效应被认为是介导前茬作物影响后茬作物表现的重要机制。前茬作物通过根系分泌、根际养分耗竭和残体输入对土壤微生物群落进行过滤，使部分微生物效应在作物收获后持续存在，进而影响后茬作物的养分获取和生长。已有烟草轮作研究报道轮作可提高有益细菌相对丰度、增强细菌多样性并增加微生物共现网络复杂度。然而，在“哪些轮作富集类群具有可验证的植物促生功能”这一问题上，仍缺乏从群落水平关联到菌株水平功能的证据链。特别是在大麦-烟草体系中，尚需明确大麦收获后哪些细菌类群持续富集、这些类群是否含有具备养分转化相关表型的可培养成员，以及代表性菌株回接后能否促进烤烟生长和养分积累。

二、研究内容与结论

基于上述问题，研究人员整合长期田间试验、扩增子测序、可培养微生物分离和盆栽回接试验，提出假设：大麦轮作将产生区别于烤烟-休闲系统的土壤微生物群落，并富集与养分转化和植物促生相关的候选细菌类群，其中部分可培养代表菌株在受控条件下具有促进烤烟生长和养分获取的潜力。研究目的包括：表征大麦轮作后土壤化学性质、酶活性和微生物群落的响应；筛选并分离候选富集细菌类群的可培养代表；通过体外功能表型鉴定和温室盆栽试验评估其植物促生潜力。该研究旨在建立田间尺度群落变化与菌株水平功能验证之间的初步联系，为筛选潜在植物促生细菌提供理论依据和候选微生物资源。

三、关键技术方法

研究人员在云南省丽江市玉龙县石鼓镇芦瓦村开展三年连续定位田间试验，设置烤烟-休闲系统（CK）和烤烟-大麦轮作系统（DM）两种种植制度，每个处理4个独立田间小区。土壤样品于2025年4月大麦收获后、下一季烤烟移栽前采集，每个小区采用五点取样法采集0-20 cm耕层土壤并混合为一份代表样品。研究采用土壤化学性质与酶活性测定、细菌16S rRNA V3-V4区和真菌ITS1区扩增子高通量测序（Illumina HiSeq 2500平台）、多种选择性培养基可培养细菌分离、16S rDNA Sanger测序鉴定、体外功能表型筛选以及温室盆栽回接试验等技术方法。测序数据已提交至NCBI，细菌序列BioProject编号为PRJNA1520269，真菌序列为PRJNA1520276。

四、研究结果

1. 1.
   烟草-大麦轮作对土壤化学性质的影响

与CK相比，DM处理显著提高了土壤pH、有机质（SOM）、全钾（TK）、溶解性有机碳（DOC）、碱解氮（HN）、速效磷（AP）和速效钾（AK），增幅分别为0.96%、3.80%、3.88%、19.65%、5.90%、3.23%和5.45%（P < 0.05）。土壤全氮（TN）、全磷（TP）和阳离子交换量（CEC）无显著差异。结果表明DM处理有效改善了植烟土壤化学性质，促进了土壤速效养分的活化与积累。

1. 2.
   烟草-大麦轮作对土壤酶活性的影响

与CK相比，DM处理显著增强了植烟土壤多种关键水解酶活性。碳循环相关的蔗糖酶（SC）和β-葡萄糖苷酶（β-GC）活性分别显著提高23.80%和66.28%（P < 0.05）；磷循环相关的酸性磷酸酶（ACP）活性显著提高15.23%；参与几丁质降解的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）增幅最大，达到176.32%。氮循环相关的脲酶（UE）和氧化应激调节相关的过氧化氢酶（CAT）活性在两种轮作模式间无显著差异。

1. 3.
   土壤微生物多样性对烟草-大麦轮作的响应

细菌和真菌α多样性呈现相反的响应模式。与CK相比，DM使细菌Shannon、Chao1和ACE指数分别降低8.35%、17.50%和18.79%（P < 0.05），而Simpson指数提高66.30%；真菌Shannon、Chao1和ACE指数分别提高28.00%、9.58%和9.84%，Simpson指数降低67.14%。基于Bray-Curtis距离的PCoA分析显示，CK和DM的细菌和真菌群落组成均明显分离。PERMANOVA表明细菌群落结构在两种处理间差异显著（pseudo-F = 9.063，R2 = 0.602，P = 0.029），对应PERMDISP分析无显著差异，说明细菌PERMANOVA结果主要反映处理间群落组成差异。真菌群落PERMANOVA同样显著（pseudo-F = 51.715，R2 = 0.896，P = 0.029），但PERMDISP也显著（F = 34.296，P = 0.029），表明真菌结果可能同时受群落质心位置差异和组内离散度影响，需谨慎解读。

1. 4.
   土壤微生物群落结构对烟草-大麦轮作的响应

门水平上，细菌中变形菌门（Pseudomonadota）和酸杆菌门（Acidobacteriota）为两种处理优势门，其相对丰度在DM下分别从36.75%增至42.21%、从19.88%增至22.04%。属水平上，DM显著提高了鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、假拉布里斯菌属（Pseudolabrys）和伯克霍尔德菌-卡巴勒罗尼亚菌-副伯克霍尔德菌（Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia）的相对丰度，增幅为26.16%-61.15%；显著降低了黄杆菌属（Flavobacterium）、MND1和尼奥芽孢杆菌属（Neobacillus）的相对丰度，降幅为29.23%-50.27%（P < 0.05）。真菌门水平上，DM下子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）和被孢霉门（Mortierellomycota）相对丰度分别从47.43%增至62.75%、6.16%增至15.33%、6.95%增至13.12%，而壶菌门（Chytridiomycota）从37.42%降至2.67%。属水平上，被孢霉属（Mortierella）、枝孢属（Cladosporium）和Saitozyma相对丰度显著增加128.18%-707.07%，而Albifimbria和Lobulomycetales_gen_Incertae_sedis显著降低73.13%和98.84%。

1. 5.
   候选富集微生物类群及其与土壤环境因子的关联

Mantel检验显示土壤微生物群落组成与多项土壤化学性质和酶活性变量存在显著统计关联。Spearman相关分析表明，DM下鞘氨醇单胞菌属相对丰度较高，并与TN、AP、HN、β-GC、DOC、AK、SOM和TK显著相关；伯克霍尔德菌-卡巴勒罗尼亚菌-副伯克霍尔德菌在DM下同样富集，并与ACP、HN、SC、β-GC、DOC、AK、SOM和TK显著相关。真菌中，Schizothecium、枝孢属、毛束霉属（Trichocladium）和Neopyrenochaeta在DM下富集，并与NAG、SOM、ACP、HN和AP等环境因子存在不同程度的显著关联。综合差异丰度和环境关联结果，鞘氨醇单胞菌属和伯克霍尔德菌-卡巴勒罗尼亚菌-副伯克霍尔德菌同时满足在DM下相对富集、属于相对丰度较高的差异细菌类群、与多项土壤养分或酶活性变量显著统计关联三个条件，因此被定义为候选富集细菌类群。

1. 6.
   候选富集类群可培养菌株的分离与初步分类鉴定

研究人员利用NA、TSA和R2A培养基共获得255株可培养细菌分离物，基于16S rRNA基因序列比对初步归属于4个门64个属。整合扩增子测序鉴定的两个候选富集细菌类群，获得6株相关可培养分离菌：DM9、DM30、DM31、DM53、DM67和DM255。DM9、DM30和DM255的最近参考菌株分别为Burkholderia paludis MSh1、Burkholderia ambifaria AMMD和Paraburkholderia graminis C4D1M，序列相似性分别为99.93%、99.86%和99.43%；DM31、DM53和DM67分别与Sphingomonas sanxanigenens DSM 19645、Sphingomonas bisphenolicum AO1和Sphingomonas oligophenolica JCM 12082最为相近，相似性分别为98.98%、99.49%和99.14%。系统发育树显示6株菌与不同参考类群聚类，表明在16S rRNA初步分类水平上并非同一参考谱系的重复分离株。研究明确指出OTU是扩增子群落分析中使用的聚类单元，不适合直接描述独立培养的分离菌株，因此不将这6株菌称为6个OTU，菌株间高分辨率分类关系仍需全基因组数据确认。

1. 7.
   候选菌株在培养条件下的功能表型

研究人员对6株分离菌筛选了9类与植物养分获取或底物利用相关的功能表型，包括无氮培养基生长、无机磷溶解、有机磷转化、钾溶解、锌溶解、木质素降解、纤维素酶活性、蛋白质降解和铁载体产生。不同菌株表现出不同的功能组合，表明这些分离菌在培养条件下存在功能多样性。生长动力学分析显示，DM30、DM9和DM255在16 h达到最大生物量（OD₆₀₀分别为0.445、0.453和0.359），DM53在36 h达到最大值（OD₆₀₀ = 0.487），DM31和DM67在40 h达到最大值（OD₆₀₀分别为0.447和0.466），随后均呈下降趋势。双层琼脂牛津杯法未观察到明显抑菌圈，表明6株菌之间无拮抗作用，生物相容性良好。

1. 8.
   候选菌株对烤烟生长性状的影响

移栽后第50天测定烤烟农艺性状。单因素方差分析显示，菌株发酵液处理的所有农艺性状均显著优于两个对照组（P < 0.05）。与CK1相比，T1处理（鞘氨醇单胞菌接种）显著提高株高、茎围、地上部鲜重、根鲜重、地上部干重和根干重，增幅分别为24.39%、25.78%、88.40%、152.13%、115.53%和116.17%；T2处理（伯克霍尔德菌-卡巴勒罗尼亚菌-副伯克霍尔德菌接种）相应指标分别提高20.87%、25.33%、80.46%、118.41%、134.63%和156.44%。T3混合菌株处理在关键生长和生物量指标上提升最为突出：茎围提高31.69%，地上部干重和根干重分别提高168.49%和179.21%，株高、地上部鲜重和根鲜重分别显著提高23.94%、86.30%和141.96%。结果表明候选菌株在受控温室条件下具有促进烤烟生长的潜力，但不能据此推断田间等效效应。

1. 9.
   核心菌株对烤烟植株元素含量和植烟土壤化学性质的影响

CK1和CK2对照组之间植株元素含量无显著差异（P > 0.05），表明R2A培养基本身对植株元素积累无显著影响。T1、T2和T3接种处理均显著提高了烤烟植株地上部和根部氮、磷、钾含量（P < 0.05）。其中T3混合菌株处理效果最为突出，地上部TN、TP和TK含量分别达到11.85 ± 1.23 g/kg、3.79 ± 0.26 g/kg和60.20 ± 3.97 g/kg，较CK1分别显著提高29.48%、29.83%和39.02%；根部相应元素含量分别为11.95 ± 0.29 g/kg、3.79 ± 0.05 g/kg和29.78 ± 2.66 g/kg，增幅分别为16.92%、19.25%和29.93%。T1和T2处理虽也提高植株元素含量，但效果总体低于T3，提示这些菌株之间存在协同效应。移栽后第50天根际土壤化学指标测定显示，各处理间土壤SOM、TN、TP、TK和HN含量无显著差异（P > 0.05），但接种处理（T1、T2、T3）的土壤DOC和AK含量显著低于两个对照组（P < 0.05），T3混合菌株处理AP含量最高且显著高于其他所有处理。这些变化与接种后植株养分积累增加同步发生，但土壤速效养分的降低或升高可能受植物吸收、微生物代谢和土壤化学平衡共同影响，不能单独据此认定候选菌株直接驱动了土壤养分循环。

五、讨论总结与结论翻译

讨论部分指出，三年连续大麦轮作显著提高了土壤pH和多项速效养分指标，其中DOC增幅最大，而TN和TP无显著变化，表明大麦轮作主要改变了土壤活性碳库和养分有效性，而非总养分库。大麦根系分泌物和残体分解可能增加生物有效有机碳输入，残体分解产生的有机酸、离子交换和微生物代谢活动可能促进部分土壤磷钾从难利用形态向速效形态转化。土壤酶活性变化进一步支持大麦轮作与土壤生化过程改变之间的关联，蔗糖酶和β-葡萄糖苷酶活性升高与DOC浓度升高一致，酸性磷酸酶活性与速效磷同步升高提示磷矿化在轮作下更为活跃，NAG显著升高表明含氮有机物转化潜力发生变化。然而，土壤酶活性和养分浓度的同步变化仍属过程层面的关联性证据，不能确定特定微生物类群直接导致了相应养分变化。

微生物群落对轮作表现出类群特异性响应。细菌多样性降低可能反映大麦轮作下更强的环境过滤作用，使能快速利用根系分泌物和新鲜有机底物的类群获得竞争优势，提高群落优势度并降低均匀度；真菌多样性升高则与大麦根系残体和秸秆还田增加结构碳和复杂有机底物、为不同降解能力的真菌提供更多生态位有关。β多样性分析显示三年连续轮作产生了区别于烤烟-休闲系统的土壤微生物群落结构，群落重组可能受根系分泌物选择性招募、残体输入改变底物类型和资源可利用性、土壤pH和养分状况变化导致的环境过滤以及微生物间资源竞争和生态位分化等多过程共同影响。由于研究未直接测定根系分泌物组成、微生物扩散过程及随机性和确定性过程对群落组装的相对贡献，这些过程应视为对观测模式的生态学解释而非已验证机制。

属水平上，鞘氨醇单胞菌属和伯克霍尔德菌-卡巴勒罗尼亚菌-副伯克霍尔德菌在DM下相对富集并与多项土壤变量显著相关，已有研究报道这些属的部分成员具有有机污染物降解、植物激素产生、磷转化或其他植物促生功能。但相关分析不能证明这些类群直接调控土壤碳氮磷钾循环，也不能证明它们是轮作效应的必要介导者，因此将其定义为候选富集类群而非机制验证的核心功能微生物。可培养分离提供了与群落水平关联互补的菌株水平证据，255株可培养细菌中包含6株归属于目标类群的分离菌，体外功能筛选显示这些菌株具有无氮培养基生长、磷转化、钾溶解、锌溶解、铁载体产生和有机底物降解等不同功能表型组合，为扩增子群落结果提供了实验支持。但培养条件下的表型仅反映特定实验条件下的潜在功能，无氮培养基生长只能作为潜在固氮能力的初步指示，不等于在盆栽或田间环境中有效固氮。盆栽回接试验显示接种候选菌株改变了烤烟生长和养分积累，部分混合接种处理促进效果相对显著，提供了比相关分析更直接的功能证据。

研究仍存在若干局限：扩增子测序无法直接解析功能基因表达或代谢活性；候选菌株分类鉴定主要依赖16S rRNA；关键真菌未进行功能验证；未进行根际定殖追踪和田间回接。微生物接种剂的田间表现还取决于定殖能力、环境适应性、与土著微生物的相互作用及跨季节稳定性，因此这些分离菌应视为候选微生物资源而非可直接农业应用的成熟接种剂。未来研究应整合全基因组、宏基因组或宏转录组方法，结合菌株特异性定量和标记追踪，并通过多点位、多季节田间试验检验生态功能和促生效果的稳定性。

研究结论：本研究表明，连续三年烤烟-大麦轮作伴随土壤DOC、AP、AK和HN含量升高，多种水解酶活性增强，以及细菌和真菌群落结构改变。鞘氨醇单胞菌属和伯克霍尔德菌-卡巴勒罗尼亚菌-副伯克霍尔德菌因在DM下相对富集且与多项土壤变量显著相关而被选为候选富集细菌类群。从这些类群获得的6株可培养分离菌在体外表现出不同的植物促生相关表型组合，混合接种在温室条件下促进了烤烟生长和养分积累。这些结果建立了田间尺度群落变化与候选菌株功能验证之间的初步联系，但尚未证明特定微生物直接介导了大麦轮作下土壤性质和烤烟生长的改善。因此，微生物富集应视为解释轮作效应的潜在机制之一，其实际生态贡献需通过原位定殖研究、功能组学和田间回接试验进一步验证。