《Frontiers in Plant Science》：Identification of the TLP gene family in Rosaceae and function of PbrTLP28 in leaf disease resistance
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类甜蛋白（thaumatin-like proteins，TLPs）由多种生物与非生物信号诱导产生，具有抗真菌活性，并在植物发育与胁迫防御中发挥重要作用。然而，关于蔷薇科（Rosaceae）果树中TLP基因家族的鉴定及其在叶片抗病性中的具体功能研究仍然有限。本
类甜蛋白（thaumatin-like proteins，TLPs）由多种生物与非生物信号诱导产生，具有抗真菌活性，并在植物发育与胁迫防御中发挥重要作用。然而，关于蔷薇科（Rosaceae）果树中TLP基因家族的鉴定及其在叶片抗病性中的具体功能研究仍然有限。本研究从五个蔷薇科基因组（森林草莓Fragaria vesca、苹果Malus domestica、白梨Pyrus bretschneideri、梅Prunus mume和桃Prunus persica）中鉴定出177个TLP基因，并根据系统发育与结构特征将其分为11个亚家族（Group 1–11）。不同的基因复制模式促进了TLP基因家族的扩张，而纯化选择是TLP进化的主要驱动力。值得注意的是，表达分析显示PbrTLP28在黑斑病感染后显著上调。信号肽预测、保守结构域分析及亚细胞定位实验证实PbrTLP28是一种分泌蛋白。功能实验表明，沉默PbrTLP28会减弱梨叶片对黑斑病的抗性，表明PbrTLP28在抗病中发挥作用。综上所述，这些发现为蔷薇科植物TLP基因的功能、表达及进化提供了重要见解。
论文解读文章
一、研究背景与研究目的
类甜蛋白（thaumatin-like proteins，TLPs）属于病程相关蛋白家族5（pathogenesis-related protein family 5，PR-5），因其与来自非洲竹芋的甜蛋白奇异果素（thaumatin）高度同源而得名。TLPs具有广泛的生物学活性，包括抗真菌、β-1,3-葡聚糖酶、过敏原及酶抑制活性，其中抗真菌活性是其最主要的功能。TLPs主要通过裂解真菌孢子、抑制孢子萌发及降低新生菌丝活力来抵御真菌侵染。此外，TLPs还参与植物对非生物胁迫的响应、授粉、开花时间调控及种子萌发等生理过程。
尽管TLPs已在多个物种中被鉴定和功能表征，但在蔷薇科果树中的系统鉴定及其在叶片抗病中的具体功能研究仍十分有限。蔷薇科包含众多重要的经济果树，如梨、苹果、桃、李和草莓，其基因组测序工作的完成为TLP基因家族的系统分析奠定了基础。因此，研究人员旨在通过对蔷薇科五种代表性果树的TLP基因家族进行全基因组鉴定与进化分析，并重点探究梨树中PbrTLP28在黑斑病抗性中的作用机制，为蔷薇科果树抗病育种提供候选基因资源。
二、主要技术方法
研究人员采用了多层次的生物信息学与分子生物学方法。首先，利用隐马尔可夫模型（Hidden Markov Model，HMM）搜索与BLASTP比对，结合SMART和InterPro在线工具进行保守结构域验证，从五个蔷薇科基因组（白梨、苹果、森林草莓、桃和梅）中鉴定TLP家族成员。其次，通过MEGA 7.0软件采用邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树，使用GSDS 2.0分析基因结构，MEME v5.5.8鉴定保守基序，MCScanX进行共线性分析与复制模式鉴定，TBtools计算非同义替换率（Ka）与同义替换率（Ks）比值。此外，通过转录组数据分析与实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测基因表达模式，采用农杆菌介导的瞬时转化进行亚细胞定位，并利用病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）技术验证PbrTLP28在梨叶片黑斑病抗性中的功能。
三、研究结果
3.1 蔷薇科TLP基因的鉴定与分类
通过BLASTP和HMMER筛选，结合SMART和InterPro工具的保守类甜蛋白结构域验证，研究人员从五个蔷薇科基因组中共鉴定出177个TLP基因，其中梨和苹果各40个，草莓32个，桃35个，梅30个。系统发育分析将所有TLP蛋白分为11个独立分支（Group 1–11），其中Group 11是一个不同于拟南芥和水稻TLP亚群的新型独立分支。
3.2 TLP蛋白理化性质分析
所有TLP成员的氨基酸长度范围为75至914个氨基酸，分子量从8,402.76 Da到99,602.67 Da，等电点从4.13到9.26不等。63.28%的TLP蛋白具有负的总平均亲水性（grand average of hydropathicity，GRAVY）评分，表明大多数TLP蛋白为亲水性蛋白。50.28%的TLP蛋白不稳定指数低于40，提示这些蛋白可能较为稳定。92.66%的TLP蛋白脂肪族指数低于80，表明大多数TLP蛋白的热稳定性较差。
3.3 外显子-内含子与保守基序分析
基因结构分析显示，38个TLP基因含有一个外显子，79个含有两个，45个含有三个，其余15个含有至少四个外显子。同一亚组的TLP基因倾向于具有相似的基因结构。保守基序分析揭示了五个保守基序（Motif 1–5），它们共同构成了保守的类甜蛋白结构域。
3.4 染色体定位与进化分析
TLP基因家族通过五种复制模式扩张：全基因组复制（whole-genome duplication，WGD）占30.5%，串联复制（tandem duplication，TD）占25.4%，分散复制（dispersed duplication，DSD）占19.8%，近端复制（proximal duplication，PD）占16.9%，转座复制（transposed duplication，TRD）占7.3%。WGD在苹果和梨的TLP家族扩张中贡献显著，而TD在桃、梅和草莓中起主要作用。Ka/Ks比值分析显示，除五对基因外，所有基因对的Ka/Ks值均小于1，表明纯化选择是TLP家族进化的主要驱动力。
3.5 PbrTLP家族成员表达分析
转录组数据与qRT-PCR验证结果显示，PbrTLP8、PbrTLP23和PbrTLP28在叶片中高表达，其中PbrTLP28的表达水平最高。黑斑病感染后，PbrTLP28在接种后24小时开始被诱导表达，并在72小时达到峰值，表明PbrTLP28可能在梨叶片的抗病反应中发挥重要作用。
3.6 PbrTLP28蛋白的亚细胞定位
信号肽预测显示PbrTLP28的N端含有一个明显的信号肽区域，结构域分析进一步确认其N端具有信号肽、C端具有类甜蛋白结构域。瞬时表达PbrTLP28-GFP融合蛋白于本氏烟草表皮细胞后，荧光信号分布在质膜附近和细胞核周围。经2 M NaCl处理引发质壁分离后，PbrTLP28-GFP荧光信号出现在细胞壁与质膜之间，证实PbrTLP28是一种分泌蛋白，在内质网合成后经细胞质运输至胞外区域。
3.7 沉默PbrTLP28增加梨对黑斑病的易感性
通过VIGS技术沉默PbrTLP28基因后，三个独立株系中PbrTLP28的转录水平分别降低了77%、75%和68%。接种黑斑病病原菌6天后，pTRV-PbrTLP28株系表现出更严重的病害症状和显著更大的病斑面积，表明沉默PbrTLP28减弱了梨叶片对黑斑病的抗性，证明PbrTLP28作为正调控因子参与黑斑病抗性。
四、讨论与结论
讨论部分指出，蔷薇科TLP基因家族的系统分析填补了该类群在该领域的研究空白。梨和苹果因经历近期全基因组复制事件而拥有更多的TLP基因，这与WGD在二者TLP家族扩张中的主导作用一致。纯化选择是TLP家族进化的主要驱动力，这可能与长期驯化和优质抗病品种选育有关。PbrTLP18在花柱中特异性高表达，PbrTLP36和PbrTLP32在花粉发育过程中强烈表达，暗示TLPs参与生殖发育过程。PbrTLP28在叶片中高表达且在黑斑病感染后迅速上调，沉默该基因导致抗病性下降，表明PbrTLP28是梨叶片抗黑斑病的正调控因子。综合而言，本研究为蔷薇科植物TLP基因的功能、表达及进化提供了重要见解，并为梨树抗病育种提供了有价值的候选抗性基因资源。
