《Frontiers in Immunology》：IKK-β inhibitor TPCA-1 increases Gd-IgA1 production and decreases C1GALT1 expression in EBV-immortalized B cells from human donors
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IgA肾病（IgAN）是一种常见的原发性肾小球肾炎，其病理特征为肾小球内以IgA为主的（共）优势免疫复合物沉积。这些沉积物富含部分O-聚糖缺乏半乳糖的IgA1糖型（Gd-IgA1）。循环中的Gd-IgA1被IgG自身抗体结合形成免疫复合物，其中部分沉积于肾小球
IgA肾病（IgAN）是一种常见的原发性肾小球肾炎，其病理特征为肾小球内以IgA为主的（共）优势免疫复合物沉积。这些沉积物富含部分O-聚糖缺乏半乳糖的IgA1糖型（Gd-IgA1）。循环中的Gd-IgA1被IgG自身抗体结合形成免疫复合物，其中部分沉积于肾小球并诱发肾损伤。基因组学和免疫学研究表明，促炎信号通路参与IgAN中Gd-IgA1的产生。基因组研究已鉴定出多个与IgAN相关的遗传位点，并提示这些位点汇聚于NF-κB通路，其中包括编码NF-κB亚基p65的RELA基因。然而，NF-κB通路影响IgA1产生细胞O-糖基化的机制尚不清楚。研究人员利用源自IgAN患者和健康对照外周血单个核细胞的EBV永生化B细胞，发现使用IKK-β抑制剂TPCA-1抑制p65 NF-κB可降低p65 NF-κB的磷酸化并减少IgA1的产生，同时反而增加Gd-IgA1的产生。这一效应对Gd-IgA1的影响可能与编码IgA1 O-聚糖半乳糖基化关键酶的C1GALT1基因表达降低有关。流式细胞成像分析揭示了p65 NF-κB与共转录因子SP1（C1GALT1的转录激活因子）之间核转位和共定位的变化，提示NF-κB通路与SP1的关联通过转录调控C1GALT1表达进而影响IgA1 O-糖基化。此外，长期IKK-β抑制改变了B细胞亚群，促进了具有浆母细胞样表型（以高SSC MFI和CD138表达为特征）的细胞生成。综上所述，这些发现表明p65 NF-κB及其转录伙伴参与IgA1 O-糖基化的调控。
一、研究背景与问题
IgA肾病（IgAN）是全球许多国家最常见的原发性肾小球肾炎，通过肾活检确诊，其病理特征为肾小球中以IgA1亚类为主的免疫复合物沉积，这些IgA1富含铰链区O-聚糖缺乏半乳糖的糖型（Gd-IgA1）。IgAN与显著的发病率和死亡率相关，多数患者最终进展至肾衰竭。目前虽有新疗法和临床试验中的候选药物，但该病仍无法治愈。
IgAN的发病机制遵循多击假说：在遗传易感个体中，Gd-IgA1被IgG自身抗体识别，形成的免疫复合物与补体C3等蛋白结合，部分循环复合物进入肾小球系膜区，激活系膜细胞增殖并过度产生细胞因子、趋化因子和细胞外基质成分，导致肾损伤。因此，IgAN可被视为自身免疫性疾病，Gd-IgA1是自身抗原，其循环水平升高与疾病进展相关。阐明Gd-IgA1的产生机制对开发新疗法至关重要。
IgA1的核心1 O-糖基化在产生IgA1细胞的高尔基体中分步进行：GalNAc转移酶将N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）连接至α1重链铰链区的丝氨酸或苏氨酸残基，随后由半乳糖基转移酶C1GalT1添加半乳糖（Gal），功能性C1GalT1蛋白需要分子伴侣C1GalT1C1（Cosmc）的辅助。既往研究显示，IgAN患者外周血来源的IgA1分泌细胞中C1GalT1和C1GalT1C1表达及活性降低，而ST6GalNAc2表达及活性升高。全基因组关联研究（GWAS）发现C1GALT1和C1GALT1C1基因位点与血清Gd-IgA1水平相关。
GWAS已鉴定出30多个IgAN遗传风险位点，其中多个位点提示汇聚于NF-κB通路，包括编码NF-κB转录因子家族亚基的REL和RELA基因、编码APRIL的TNFSF13基因，以及编码TNF相关共刺激配体的TNFSF4和TNFSF18基因。经典NF-κB通路中，TNF-α和TLR配体诱导IKK-β磷酸化IκBα，释放p65（RelA）/p50二聚体转位至细胞核激活靶基因转录。由于NF-κB信号对B细胞活化、增殖和IgA类别转换等多种功能至关重要，难以用原代细胞单独界定该通路对IgA1 O-糖基化这一单一性状的作用。因此，研究人员利用具有组成性NF-κB活化的EBV永生化B细胞，评估IKK-β抑制是否改变IgA1 O-糖基化。
二、研究内容与主要技术方法
研究人员使用IKK-β小分子抑制剂TPCA-1处理源自IgAN患者（n=19）和健康对照（n=12）外周血单个核细胞的EBV永生化B细胞，评估IKK-β抑制对IgA1分泌、IgA1半乳糖缺乏程度及O-糖基化相关糖基转移酶基因表达的影响，并表征持续p65 NF-κB抑制对B细胞亚群表型和细胞内信号的影响。
主要关键技术方法包括：ELISA检测分泌型IgA1和Gd-IgA1浓度；SDS-PAGE和western blot检测p65 NF-κB S536磷酸化水平；定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）检测C1GALT1、COSMC、ST6GALNAC2、IGHA1和JCHAIN基因表达；流式细胞术分析B细胞亚群表型（SSC-A、HPA凝集素结合、p65 NF-κB、SP1、IgA1、CD138等）；ImageStream成像流式细胞术分析p65 NF-κB和SP1的核转位及共定位。
三、研究结果
3.1 TPCA-1增加Gd-IgA1产生并降低p65 NF-κB S536磷酸化
经浓度优化后选用4 μM TPCA-1，该浓度不显著改变细胞数量和活力。TPCA-1处理48小时降低多数细胞系的IgA1分泌，增加半乳糖缺乏程度，相对变化分析显示Gd-IgA1显著增加（p<0.01）。另一种NF-κB抑制剂BAY11呈现相同方向变化。Western blot证实TPCA-1处理1小时显著降低磷酸化p65（S536）水平，而总p65蛋白不变。
3.2 TPCA-1降低β1,3-半乳糖基转移酶编码基因C1GALT1表达
qRT-PCR显示TPCA-1处理1小时后，所有细胞系C1GALT1表达均下降（p=0.01），而COSMC、ST6GALNAC2、IGHA1和JCHAIN表达无显著变化。
3.3 TPCA-1增加SSC-high亚群比例，该亚群p65 NF-κB和SP1含量较低
流式细胞术显示TPCA-1处理48小时显著增加SSC-high细胞频率，HPA高结合细胞（反映细胞表面可及性未修饰GalNAc增多）具有更高的SSC-A平均值。48小时时，p65 NF-κB高表达细胞比例下降而低表达细胞比例上升，SP1阳性细胞频率显著下降而SP1阴性细胞频率上升。
3.4 SSC将细胞分为p65 NF-κB、IgA和SP1蛋白水平不同的亚群
SSC-low细胞在各条件下各时间点的总IgA（细胞表面+胞内）显著高于SSC-high细胞。1小时时SSC-low细胞SP1蛋白水平显著高于SSC-high细胞。48小时TPCA-1处理后，SP1表达差异仅在TPCA-1处理组中显著（p<0.001）。
3.5 SSC和IgA亚群表现出差异性的p65 NF-κB和SP1核转位活性
ImageStream分析显示，SSC-low细胞在1小时和48小时的SP1核转位均显著高于SSC-high细胞。SSC-low细胞在各处理条件下p65 NF-κB-SP1共定位显著高于SSC-high细胞。IgA阴性细胞在1小时所有组中p65 NF-κB核转位显著高于IgA阳性细胞，且各条件下1小时和48小时的SP1核转位均显著更高。
四、讨论与结论
研究人员首次提供了经典p65 NF-κB信号参与调控人B细胞IgA1 O-糖基化的实验证据。TPCA-1在1小时内降低C1GALT1表达，早于SP1蛋白水平变化，提示早期O-糖基化改变反映转录活性变化。SP1是已知的C1GALT1正向调控转录因子，也能与p65 NF-κB形成复合物。48小时时p65 NF-κB高表达群体与SP1阳性群体的下降平行发生，提示p65 NF-κB可能以依赖方式招募SP1至其天然启动子位点。Gd-IgA1产生与总IgA1输出受独立机制调控：基线IgA1水平与处理条件强相关，而Gd-IgA1基线水平与TPCA-1处理后水平无相关性，表明IKK-β抑制对O-糖基化的影响幅度因细胞系而异。TPCA-1将细胞分布转向高颗粒度（SSC-high）亚群，这些细胞富含HPA结合的细胞表面糖缀合物，提示未修饰GalNAc增多，且CD138表达升高，符合浆细胞样表型，与IgAN患者循环中Gd-IgA1产生细胞富集于浆母细胞样细胞一致。p65 NF-κB磷酸化在1小时短暂下降后24小时内恢复，而48小时的表型变化（SSC群体偏移和SP1阳性群体频率下降）可能代表急性干扰后持续存在的下游后果。这些发现将GWAS鉴定的NF-κB通路相关易感位点与IgAN发病中的自身抗原Gd-IgA1产生联系起来，为理解IgAN的自身免疫分子起源和开发靶向发病机制的治疗策略提供了新方向。
