《Frontiers in Immunology》：Integrative bulk and single-cell transcriptomics links amino acid metabolism-related biomarkers to endothelial immune remodeling in periodontitis
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背景： 牙周炎（PD）是一种由微生物失调和免疫介导的牙周组织破坏驱动的慢性炎症性疾病。尽管氨基酸代谢失调已被认为与炎症性疾病相关，但其在PD中的诊断相关性及细胞背景仍不清楚。研究人员旨在鉴定氨基酸代谢相关的诊断生物标志物，并表征其在PD中的潜在作用。
方法
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背景： 牙周炎（PD）是一种由微生物失调和免疫介导的牙周组织破坏驱动的慢性炎症性疾病。尽管氨基酸代谢失调已被认为与炎症性疾病相关，但其在PD中的诊断相关性及细胞背景仍不清楚。研究人员旨在鉴定氨基酸代谢相关的诊断生物标志物，并表征其在PD中的潜在作用。
方法： 分析了bulk转录组数据集（GSE16134、GSE10334和GSE223924）以及一个单细胞RNA测序数据集（GSE164241）。鉴定氨基酸代谢相关差异表达基因，并通过富集分析进行功能注释。LASSO回归、Boruta和随机森林联合筛选诊断生物标志物。构建列线图，并通过ROC、校准和决策曲线分析进行评估。进行了免疫浸润分析、共识聚类和加权基因共表达网络分析；利用单细胞数据进行细胞类型定位、细胞间通讯和伪时间分析。通过组织学分析、免疫组织化学和定量实时PCR（RT-qPCR）使用人牙龈组织样本进行验证。
结果： 六个氨基酸代谢相关生物标志物在三个bulk数据集中表现出一致的表达变化。TDO2、ICAM2、VWF和FABP4在牙周炎中上调，而ACAT2和AHNAK2下调。六基因列线图在GSE16134中区分PD与对照（AUC = 0.956），而跨平台评估揭示了校准局限性。富集分析将这些生物标志物与趋化因子和细胞因子信号传导、细胞黏附及白细胞跨内皮迁移相关联。免疫浸润和共识聚类揭示了广泛的免疫关联及三个具有不同炎症特征的表达亚组。单细胞分析将最高生物标志物活性定位于内皮细胞，尽管其比例相对减少，但内皮细胞显示出最强的诊断生物标志物模块评分。伪时间分析揭示了生物标志物表达沿推断的内皮轨迹的变化，而CellChat预测了内皮-免疫通讯的改变。实验验证在临床样本中于mRNA和蛋白水平确认了TDO2、ICAM2、VWF、FABP4和ACAT2的这些变化。
结论： 研究人员鉴定了六个具有PD诊断潜力的氨基酸代谢相关候选生物标志物——其中五个得到临床牙龈组织表达数据的支持——并将其与内皮细胞状态改变和免疫微环境重塑联系起来。这些发现为PD的生物标志物开发和机制研究提供了免疫-代谢框架。
论文解读文章：
一、研究背景与科学问题
牙周炎（periodontitis, PD）是一种慢性非传染性疾病，由牙周微生物失调与宿主免疫炎症反应的相互作用驱动，渐进性破坏牙龈、牙周膜和牙槽骨等牙支持组织，是成人牙齿丧失的主要原因之一。2021年全球疾病负担研究显示，重度牙周炎患病人数约10.7亿，年龄标准化患病率约为12.5%。机制上，PD不再被视为单纯的细菌感染，而是涉及微生物生态失衡、免疫功能障碍、氧化应激和骨重塑紊乱的相互依赖过程。在牙周病变中，上皮细胞、基质细胞、免疫细胞和成骨谱系细胞形成复杂的炎症调控网络，该网络的持续激活促进促炎介质释放和核因子κB受体活化因子配体（RANKL）下游的破骨细胞生成，导致骨形成与骨吸收解偶联。
氨基酸代谢处于营养可利用性与免疫炎症调控的交汇点。除作为蛋白质合成的底物和氮供体外，氨基酸及其代谢物通过营养感知、氧化还原稳态、表观遗传调控和受体依赖性信号传导塑造免疫细胞活化、巨噬细胞极化、T细胞分化和细胞因子释放。在PD中，牙龈组织和龈沟液的代谢组学分析已揭示广泛的氨基酸异常，涉及瓜氨酸、支链氨基酸和谷胱甘肽相关代谢物，其中多项与牙周袋深度和局部炎症负荷相关。然而，现有研究大多考察单个代谢物或单一病原体，宿主氨基酸代谢相关基因（AAM-RGs）的整体表达、诊断相关性、免疫关联及细胞类型特异性分布仍未明确。
单细胞RNA测序（scRNA-seq）为在细胞水平分辨率上解决这一问题提供了策略。牙周组织包含上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、免疫细胞和骨相关细胞，这些群体在营养摄取、代谢调控、炎症信号传导和组织重塑功能上存在差异。内皮细胞在此背景下占据尤为关键的位置：它们控制氨基酸和其他营养物质向炎症组织的输送，并调控白细胞黏附和募集，直接处于局部代谢供应与免疫浸润的交汇点。然而，bulk转录组数据代表混合组织的平均信号，无法区分细胞组成改变与特定细胞类型内的内在转录调控。因此，整合bulk转录组学与scRNA-seq可以鉴定组织水平的氨基酸代谢相关表达特征并定位其主要细胞来源，阐明这些特征与局部免疫微环境和牙周组织重塑的关系。
二、研究设计与技术方法
研究人员系统整合了三个bulk转录组数据集（GSE16134作为训练集，含310例牙龈组织样本；GSE10334作为补充可重复性评估队列；GSE223924作为独立验证集）及一个scRNA-seq数据集（GSE164241，含13例健康牙龈样本和8例牙周炎牙龈样本）。氨基酸代谢相关基因集来源于已发表的1,204个AAM-RGs。主要技术方法包括：limma差异表达分析鉴定氨基酸代谢相关差异表达基因（AAMRDGs）；LASSO回归、随机森林和Boruta三种机器学习算法联合筛选核心候选基因；多变量逻辑回归构建列线图诊断模型并通过ROC、校准曲线和决策曲线分析评估；CIBERSORT和MCP-counter两种反卷积工具进行免疫浸润分析；共识聚类识别PD分子亚型；加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定亚型相关模块；Seurat流程处理scRNA-seq数据并进行细胞类型注释；CellChat分析细胞间通讯；Monocle 2进行内皮细胞伪时间轨迹分析。临床验证使用复旦大学附属口腔医院收集的40例牙龈组织标本（20例牙周炎患者和20例健康对照），通过H&E染色、免疫组织化学和RT-qPCR进行验证。
三、主要研究结果
3.1 鉴定64个AAMRDGs
在GSE16134中，PD组的AAM-RG评分显著高于CT组。差异表达分析鉴定出1,067个DEGs（665个上调，402个下调），与AAM-RG集重叠后获得64个AAMRDGs。热图显示前20个AAMRDGs在PD和CT样本间呈现明显不同的表达模式。
3.2 64个AAMRDGs的富集与PPI网络分析
GO富集分析返回231个显著GO条目，BP条目集中于白细胞间细胞黏附、淋巴细胞和T细胞活化与分化、白细胞稳态以及氨基酸和α-氨基酸代谢过程。STRING PPI网络显示IL6、LCK、CD27和VWF具有多个蛋白水平相互作用，IL6在网路中具有最高连接度。
3.3 机器学习鉴定并验证六个诊断生物标志物
LASSO回归保留13个基因，随机森林选择18个基因，Boruta确认51个基因，三种算法交集获得六个核心候选基因：TDO2、ICAM2、ACAT2、VWF、FABP4和AHNAK2。六个基因在三个数据集中均表现出显著且方向一致的PD-CT表达差异，其中TDO2、ICAM2、VWF和FABP4在PD中一致上调，ACAT2和AHNAK2一致下调。单个基因ROC分析的AUC均不低于0.79。
3.4 六基因列线图在训练集中表现稳定诊断性能
多变量逻辑回归列线图在GSE16134中达到表观AUC 0.956（95% CI: 0.918–0.985），校准曲线接近理想参考线，DCA显示在阈值概率范围内具有正向净收益。在GSE10334中AUC为0.937，在GSE223924中AUC为0.990，但GSE223924中存在校准偏差。
3.5 六个诊断生物标志物的相互作用网络分析
STRING分析显示VWF、ICAM2和FABP4与多个相关蛋白连接，包括ASGR1、CLEC4M、ESM1、ICAM4和ESAM，主要涉及细胞黏附、血管内皮功能和免疫调控。ACAT2未保留高于置信阈值的相互作用。
3.6 六个诊断生物标志物的GSEA
细胞因子-细胞因子受体相互作用出现在所有六个生物标志物的富集结果中。TDO2富集覆盖趋化因子信号、细胞因子-细胞因子受体相互作用和造血细胞谱系；VWF映射到细胞黏附分子和白细胞跨内皮迁移；ICAM2、ACAT2和FABP4涉及B细胞受体信号等通路。
3.7 诊断生物标志物与免疫浸润及炎症介质相关
CIBERSORT分析显示ACAT2和AHNAK2具有相似的相关谱，与静息树突状细胞、静息肥大细胞、滤泡辅助T细胞和M1巨噬细胞正相关，与浆细胞负相关；而FABP4、ICAM2、TDO2和VWF与浆细胞及活化记忆CD4+ T细胞正相关。MCP-counter分析显示类似分离模式。六个生物标志物还与多种炎症介质相关。
3.8 鉴定PD中三个分子亚型
基于六个生物标志物表达谱的共识聚类在241例PD样本中解析出三个亚型：C1（n=115）、C2（n=82）和C3（n=44）。六个生物标志物在亚型间均存在显著差异：FABP4在C3中最高，ICAM2、VWF和TDO2在C2中最高，ACAT2和AHNAK2在C1中最高。
3.9 PD分子亚型呈现不同免疫和炎症特征
MCP-counter分析显示C2和C3的T细胞、细胞毒性淋巴细胞、B谱系、单核细胞谱系和内皮细胞丰度高于C1，多数细胞群在C2中丰度最高。CIBERSORT分析显示C2和C3中浆细胞浸润较高。炎症相关基因表达在三个亚型间也存在差异。
3.10 PD分子亚型的WGCNA和富集分析
WGCNA保留12个模块，MEdarkgreen与C1最强负相关（r = ?0.70）且与C2最强正相关（r = 0.67）。MEdarkgreen基因的GO-BP条目涵盖白细胞分化、免疫效应过程、B细胞活化和增殖、B细胞受体信号通路及吞噬作用，KEGG分析显示内质网蛋白加工和B细胞受体信号通路富集。
3.11 scRNA-seq注释鉴定11种细胞类型
质控后最终注释数据集包含84,574个细胞（50,666个来自健康对照，33,908个来自牙周炎样本），鉴定出11种细胞群体：B细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、淋巴管内皮细胞、肥大细胞、黑色素细胞、壁细胞、髓系细胞、浆细胞和T细胞。
3.12 鉴定内皮细胞为PD中的关键细胞类型
细胞组成分析显示PD组中T细胞、浆细胞和髓系细胞相对富集，而内皮细胞、成纤维细胞和淋巴管内皮细胞相对比例降低。内皮细胞和成纤维细胞是仅有的六个诊断生物标志物在PD与CT间均显著差异的细胞类型。VWF和ICAM2主要在内皮细胞中表达，内皮细胞携带最高的诊断生物标志物模块评分，综合细胞组成、单基因差异表达、细胞类型特异性和模块评分，内皮细胞被鉴定为关键细胞类型。
3.13 细胞类型间的特定通讯
CellChat分析显示PD组的细胞间通讯数量和整体通讯强度较CT组增加，内皮细胞的传入、传出和总通讯评分均增加。配体-受体分析显示PD组内皮细胞与T细胞通讯增强，涉及SELE-CD44、COL4A1-CD44、COL4A2-CD44、CXCL12-CXCR4和HLA-B/HLA-A/HLA-E/HLA-C-CD8A等相互作用。
3.14 内皮细胞伪时间轨迹分析
内皮细胞被重新聚类为六个亚组，轨迹分析显示连续的内皮状态轨迹，含两个分支点。ICAM2和FABP4主要在早期伪时间阶段表达并随进展逐渐降低，VWF沿伪时间逐渐增加并主要在晚期内皮细胞中表达。
3.15 临床样本中诊断生物标志物表达的实验验证
H&E染色显示牙周炎样本中炎症细胞浸润和组织破坏更明显。RT-qPCR显示TDO2、ICAM2、VWF和FABP4的mRNA水平在牙周炎样本中显著升高，ACAT2水平降低。免疫组织化学分析在蛋白水平确认了这五个蛋白的差异表达，变化方向与bulk转录组数据一致。
四、讨论与结论
研究讨论指出，牙周炎正日益被理解为一种免疫代谢性疾病，局部营养可利用性和代谢信号塑造宿主炎症反应。TDO2催化色氨酸分解代谢犬尿氨酸途径的第一步，其表达升高与既往牙周炎症中色氨酸-犬尿氨酸代谢改变的报道一致，研究人员推测TDO2可能通过犬尿氨酸-芳烃受体（AhR）信号影响牙周免疫反应，但该解释仍是初步的，因为色氨酸和犬尿氨酸浓度、TDO2酶活性和AhR活化未被评估。ICAM2是β2整合素LFA-1的组成性表达内皮配体，调控腔内中性粒细胞爬行和跨内皮迁移；VWF储存于Weibel-Palade小体中，是内皮活化的经典标志，将止血与白细胞募集偶联；FABP4和ACAT2涉及脂质相关代谢。这些标志物的共上调与其在内皮-白细胞相互作用中的已知作用一致。
研究结论：研究人员鉴定了六个具有PD诊断潜力的氨基酸代谢相关候选生物标志物（TDO2、ICAM2、ACAT2、VWF、FABP4和AHNAK2），其中五个得到临床牙龈组织表达数据的支持，并将其与内皮细胞状态改变和免疫微环境重塑联系起来。这些发现为PD的生物标志物开发和机制研究提供了免疫-代谢框架。
