《Frontiers in Immunology》：Emergence of canine adenovirus infection in mink from five provinces in Northern China
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犬腺病毒1型（Canine adenovirus 1, CAV-1）是犬传染性肝炎和狐狸脑炎的病原体。然而，关于CAV-1在水貂中感染的流行病学信息仍然有限。2022年9月至2023年2月期间，研究人员从中国五个省份的18个水貂养殖场共采集了540份直肠拭子样
犬腺病毒1型（Canine adenovirus 1, CAV-1）是犬传染性肝炎和狐狸脑炎的病原体。然而，关于CAV-1在水貂中感染的流行病学信息仍然有限。2022年9月至2023年2月期间，研究人员从中国五个省份的18个水貂养殖场共采集了540份直肠拭子样本，并对病毒核酸进行了鉴定、测序和分析。各水貂养殖场的总体阳性率为34.00%，其中山东省最高（67.33%）。在山东省内，日照市水貂CAV-1阳性率达100%。根据纤突蛋白（fiber）系统发育树，秦皇岛（042803）、日照（042801）和威海（050101）等城市的纤突序列位于同一独立分支，且与从其他动物中分离的毒株不同。与CAV-1纤突蛋白（AC_000003.1）相比，所获得的纤突序列处于净化选择（purifying selection）之下。与纤突蛋白序列AP_000069.1相比，042402-TS氨基酸的突变改变了B细胞表位（B-cell epitope）及三维结构。然而，所获得的纤突序列与柯萨奇病毒和腺病毒受体（coxsackievirus and adenovirus receptor, CAR）之间的结合亲和力并无差异。这些结果表明，与其他宿主物种的毒株相比，042402毒株在纤突片段上表现出显著的遗传差异，且CAV-1在水貂中的流行已得到确认。因此，未来进一步阐明CAV-1在水貂中的进化和分子流行病学具有重要意义。
论文解读文章
一、研究背景与目的
犬腺病毒1型（Canine adenovirus 1, CAV-1）隶属于腺病毒科（Adenoviridae）哺乳动物腺病毒属（Mastadenovirus），是犬传染性肝炎和狐狸脑炎的病原体。CAV-1感染以惊厥、急性脑炎、肝炎、葡萄膜炎（角膜水肿，即“蓝眼”）和间质性肾炎为特征。近年来，CAV-1已在英国、意大利、西班牙等多个国家的犬、狼、棕熊、赤狐、耳廓狐及北极狐中被检出，表明该病毒具有广泛的宿主范围，其流行监测面临挑战。
水貂属于鼬科（Mustelidae）小型食肉动物，中国是水貂的主要养殖国之一。水貂在多种病毒性疾病的传播中扮演重要角色，例如2020年丹麦水貂养殖场暴发严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）感染，以及西班牙水貂养殖场的H5N1禽流感疫情。研究人员的既往研究已在水貂中检测到CAV-1，且发现其与狐狸中的毒株存在差异。然而，关于CAV-1在水貂中的时间与地理分布、阳性率及流行毒株特征的系统性流行病学信息仍然匮乏。因此，本研究旨在调查2022年9月至2023年2月期间中国北方山东、辽宁、河北、吉林和黑龙江五省水貂中CAV-1的流行状况，以阐明其流行病学特征。
二、研究内容与结论
研究人员从上述五省18个水貂养殖场采集了540份1岁龄水貂的直肠拭子样本（每场30份，其中雄性20份、雌性10份），通过PCR方法进行CAV-1核酸检测，并对阳性样本的纤突蛋白基因进行扩增、克隆和测序，进而开展序列分析、系统发育分析、氨基酸突变分析、B细胞表位预测、三维结构预测及受体结合亲和力分析。
研究结果显示，水貂CAV-1总体阳性率为34.00%，其中山东省最高（67.33%），日照市阳性率达100%，威海、诸城、青岛、临沂的阳性率分别为76.67%、66.67%、46.67%和46.67%；河北唐山阳性率为86.67%；辽宁锦州和瓦房店阳性率分别为70.00%和60.00%；黑龙江五家养殖场均未检出CAV-1。共获得13条水貂来源的CAV-1纤突序列，与参考序列AC_000003.1相比存在多个核苷酸突变位点。系统发育分析显示，日照（042801）、秦皇岛（042803）、唐山（042402）和威海（050101）的毒株聚为一个独立分支，与犬、狼、狐狸和熊来源的毒株存在显著遗传差异；其余水貂毒株则聚为另外两个分支，与犬源毒株亲缘关系较近。选择压力分析表明这些序列处于净化选择之下。与参考纤突蛋白AP_000069.1相比，042402-TS毒株的氨基酸突变改变了B细胞表位和三维结构，其TM-score为0.329，显示整体拓扑结构显著分化；但所有获得序列与柯萨奇病毒和腺病毒受体（CAR）的结合亲和力（ΔG和Kd）与参考序列无显著差异。
三、主要技术方法
本研究采用的主要技术方法包括：PCR扩增鉴定CAV-1（以508 bp产物区分于CAV-2的1,030 bp产物）；纤突蛋白基因的克隆与Sanger测序；基于最大似然法（maximum likelihood, ML）构建系统发育树（使用IQ-TREE软件，1,000次自举检验）；利用MEGA软件进行核苷酸与氨基酸序列比对及选择压力分析；采用IEDB工具预测线性B细胞表位；使用Swiss-MODEL预测三维结构并以US-align比较结构差异（以TM-score和RMSD为指标）；利用HawkDock Server构建纤突蛋白与CAR的结合模型，并通过PRODIGY计算结合亲和力。样本队列来源为2022年9月至2023年2月中国山东、河北、辽宁、吉林、黑龙江五省18个水貂养殖场的540份直肠拭子。
四、研究结果
CAV-1在水貂中的鉴定及阳性率：PCR产物大小为508 bp，确认为CAV-1。山东省阳性率最高（67.33%），日照市达100%；黑龙江五家养殖场均未检出。
CAV-1纤突序列分析：共获得13条纤突序列，与AC_000003.1相比在13个核苷酸位点发生突变；与AP_000069.1相比存在氨基酸突变，其中042402-TS毒株突变最多。
CAV-1纤突系统发育树：日照（042801）、秦皇岛（042803）、唐山（042402）和威海（050101）的毒株聚为独立中国分支，与犬、狼、狐狸和熊的毒株存在显著遗传差异；其余水貂毒株聚为另外两个分支。
B细胞表位、三维结构及结合亲和力：选择压力分析显示序列处于净化选择（t值为?0.201，p值为1.00）；042402-TS的氨基酸突变改变了B细胞表位，其三维结构与参考蛋白相比显著分化（TM-score为0.329）；但所有获得序列与CAR的结合亲和力与参考序列无显著差异。
五、讨论与结论
讨论部分指出，山东省水貂养殖场数量最多且地处沿海，CAV-1可能由同场饲养的犬和狐狸传播，但目前支持该假说的数据有限。辽宁皮口阳性率为0.00%，可能与养殖密度、圈舍通风和种源等因素有关。直肠拭子作为一种采样方法，具有操作简便、安全无创等优点，但可能低估真实感染率，未来需开展不同样本类型诊断敏感性的比较研究。CAV-1纤突蛋白的突变可能改变病毒抗原性，影响疫苗免疫效果和单克隆抗体敏感性；042402毒株在纤突片段上与其他宿主物种毒株存在显著遗传差异，但其与CAR的结合亲和力未受影响，表明氨基酸突变改变了B细胞表位和三维结构而未影响受体结合活性。
研究结论为：2022年9月至2023年2月中国北方水貂养殖场中CAV-1总体阳性率为34.00%，山东省最高（67.33%）；与其他宿主物种的CAV-1毒株相比，水貂来源的042402毒株在纤突基因片段上表现出显著遗传差异；未来需进一步阐明CAV-1在水貂中的进化和分子流行病学。这些发现提示水貂可能参与CAV-1在食肉动物间的传播链，其在跨物种传播中的作用有待深入研究。
