《Veterinary Microbiology》：The first complete genome sequence and pathogenicity characterization of a reassortant avian orthoreovirus genotype Ⅰ subvariant strain
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禽源正呼肠孤病毒（avian orthoreovirus，ARV）属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）正呼肠孤病毒属（Orthoreovirus），为直径70–80 nm、无囊膜的双链RNA病毒。其基因组由10个双链RNA节段组成。1954年，ARV首次从
禽源正呼肠孤病毒（avian orthoreovirus，ARV）属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）正呼肠孤病毒属（Orthoreovirus），为直径70–80 nm、无囊膜的双链RNA病毒。其基因组由10个双链RNA节段组成。1954年，ARV首次从鸡呼吸道中分离获得，1958年在中国被首次鉴定。当种鸡通过污染物或农场水平的水平传播感染病毒时，病原可经垂直传播给后代鸡。据报道，在特定田间和实验条件下，ARV可诱导鸡发生免疫抑制，可能增加并发感染和继发性细菌并发症的易感性。此外，该病毒具有显著的环境抵抗力，可能有助于其在禽舍中持续存在。种鸡接种疫苗可通过母源抗体传递为后代鸡提供保护，在孵化后最初3周这一高易感期的早期生命阶段提供被动免疫。根据电泳迁移率的差异，线性基因组片段分为三个大小类别：大（L1–L3）、中（M1–M3）和小（S1–S4）。这些节段编码12种不同的蛋白，包括构成病毒颗粒的8种结构蛋白（λA、λB、λC、μA、μB、σA、σB和σC），以及参与病毒复制和致病性的4种非结构蛋白（μNS、σNS、p10和p17）。作为一个功能性三顺反子基因，S1片段编码三种病毒产物：次要衣壳蛋白σC以及p10和p17。σC蛋白在早期感染中发挥关键作用：它介导病毒粒子与宿主细胞之间的相互作用，并诱导型特异性中和抗体。由S4基因编码的σNS是一种非结构蛋白，可结合单链RNA并介导病毒RNA的转运。作为遗传标记，编码σC的S1片段的扩增和序列测定已广泛应用于ARV田间分离株的表征和分类学鉴定。基于σC遗传进化分析，ARV在系统发育上可分为6个基因型。然而，仅基于σC基因的分类不足以识别潜在的重组事件，而由于ARV的节段化基因组，重组事件在ARV田间株中较为常见。除重组驱动的复杂进化特征外，ARV宿主范围广，可引起家禽多种生产性疾病。该病毒感染包括肉鸡、鸭、鹅和火鸡在内的多种家禽宿主，可引起关节炎、腱鞘炎和生长迟缓。全球已有报道其损害生长和生产性能。鉴于遗传重组在产生抗原多样性中的作用，全基因组测序对于准确表征新出现的田间株至关重要。值得注意的是，已有假说认为遗传重组促成了抗原变异株的出现，这些变异株可能潜在地逃逸疫苗诱导的免疫，尽管这仍有待实验验证。尽管商业ARV疫苗被广泛使用且生物安全措施不断改进，这些疫苗在田间应用中未能提供足够的保护。特别是，新出现的变异株具有显著的遗传多样性，并表现出与疫苗株不同的抗原特性。遗传变异可能导致抗原表位改变，使新型变异株能够逃逸疫苗诱导的保护性免疫应答。现有疫苗所赋予的免疫力仍不充分，导致感染率升高、疫情扩大，给家禽业造成严重经济损失。在本研究中，从山东省28日龄疑似ARV感染肉鸡的肌腱和滑液样本中分离出一株新型ARV毒株，命名为QD25。对全部10个基因片段进行的全面全基因组测序和系统发育分析显示，QD25是一株重组毒株，其S4节段（编码σNS）来源于基因Ⅲ型，而用于亚型分型的σC编码基因属于基因Ⅰ亚型。致病性试验进一步表明，QD25在无特定病原（specific pathogen-free，SPF）鸡中引起40%的死亡率和显著生长迟缓，凸显了其致病潜力。这些发现为山东省当前流行ARV毒株的遗传多样性提供了基因组学证据，并丰富了可用的生物信息学资源。
禽源正呼肠孤病毒（avian orthoreovirus，ARV）属呼肠孤病毒科（Reoviridae）正呼肠孤病毒属（Orthoreovirus），是一种无囊膜双链RNA病毒，基因组由10个双链RNA节段组成，呈全球性分布且感染高度流行，给全球家禽业造成重大经济损失，其中肉鸡和火鸡感染率最高。自2013年以来，中国实验室确诊的ARV相关关节炎发病率逐步上升，同时有新型变异株出现的报道。ARV基于σC基因的遗传进化可分为6个基因型，但仅凭σC基因分类不足以识别其节段化基因组导致的常见重组事件；此外，尽管商业ARV疫苗广泛使用且生物安全措施持续改进，田间应用中仍未能提供充分保护，新出现的变异株与疫苗株存在显著遗传和抗原差异，可能逃逸疫苗诱导的免疫应答，导致感染率升高与疫情扩大。在此背景下，研究人员从中国山东省28日龄出现关节炎临床症状的肉鸡跗关节滑膜和腱鞘组织中分离到一株新型ARV毒株QD25，并开展了全基因组测序、系统发育分析及致病性评价，旨在明确其基因组特征、重组事件及致病潜力，为当前流行ARV的遗传多样性和防控策略提供依据。
在技术方法上，研究人员采集28日龄患病肉鸡跗关节滑膜和腱鞘组织，经冻融、匀浆和离心后过滤接种鸡LMH（Leghorn male hepatocellular）细胞进行病毒分离，盲传三代并以空斑纯化，采用TCID50（50% tissue culture infectious dose，半数组织培养感染剂量）测定滴度，并以PCR排除鸡传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus，IBDV）、禽腺病毒血清4型（fowl adenovirus serotype 4，FAdV-4）和鸡传染性贫血病毒（chicken infectious anemia virus，CIAV）污染，同时进行细菌学检查排除滑液支原体、金黄色葡萄球菌和禽霍乱（多杀性巴氏杆菌）；提取病毒RNA经RT-PCR扩增σC基因后测序，并利用Illumina平台完成全基因组测序；采用SeqMan软件进行序列拼接，MEGA 11.0以最大似然法（1 000次bootstrap重复）基于σC和σNS基因构建系统发育树，并用DNASTAR Lasergene（MegAlign 11.1.0）和Jalview（2.11.4.0）进行σC氨基酸同源性分析；致病性试验以1×10
7.23 TCID50/羽的剂量经右腿肌内注射1日龄SPF鸡，设阴性对照组，逐日监测体重和死亡，分别于感染后3 d和5 d采集心、肝、脾、肺、肾、胸腺、法氏囊和关节组织，采用依据农业行业标准NY/T 540-2023的引物探针进行RT-qPCR病毒载量定量（以28S rRNA为内参），并进行H&E染色组织病理学检查；统计分析采用重复测量双因素方差分析和Student's t检验，以P < 0.01为差异显著。
研究结果显示，作者分六个部分进行阐述。3.1 毒株QD25的分离：对28日龄关节炎肉鸡关节组织匀浆进行PCR检测，扩增出981 bp特异性片段；接种LMH细胞后连续三代出现细胞病变（cytopathic effect，CPE），第三代接种后72 h约50%细胞形成合胞体，随后细胞皱缩、聚集成簇并崩解脱落；空斑纯化后的QD25经PCR筛查确认IBDV、FAdV-4和CIAV阴性，排除了后续致病性试验中共感染的可能。3.2 毒株QD25的鉴定：序列经NCBI BLAST确认为ARV阳性，10个节段全基因组序列已提交GenBank（登录号PZ337302–PZ337311）；基于σC基因的系统发育分析显示，QD25与变异株ISR5225、ISR5215、K1502030及甘肃肉鸡群分离的基因Ⅰ亚型变异株2023ARV-GS-SDAU-1在基因Ⅰ型内形成独立亚分支，疫苗株S1133位于同一基因Ⅰ型大分支内的另一亚分支；QD25与商业疫苗株S1133、1733和2408的核苷酸相似性低于80%，而与ISR5225、ISR5215约90%；氨基酸同源性分析显示QD25与S1133间存在87个氨基酸差异。3.3 遗传特征分析表明QD25为基因Ⅰ亚型重组株：基于编码σNS的S4节段系统发育分析显示，QD25的S4基因归入基因Ⅲ型，与一株σC基因亦属基因Ⅲ型的中国田间株聚在一起；而其σC基因属基因Ⅰ亚型，S4节段与σC基因呈现不同进化谱系，这种不一致的系统发育定位证实QD25为自然跨基因型重组株，其S4节段可能来源于基因Ⅲ型谱系，这是首次获得基因Ⅰ亚型重组ARV毒株的全基因组序列。3.4 QD25对SPF鸡的致病性：以1日龄SPF鸡为模型连续观察10 d，感染组体重在整个观察期均低于阴性对照组，自感染后3 d起体重进行性下降，对照组保持稳定增长；部分感染鸡死亡前表现精神沉郁、嗜睡和活动减少，剖检死亡鸡见肝脏肿胀和出血；死亡率为40%，首例死亡于感染后4 d，死亡高峰在感染后5 d，对照组无死亡，表明QD25对SPF鸡具有高致病性。3.5 QD25感染鸡的组织内病毒分布：感染后3 d的RT-qPCR检测显示，心、肝、脾、肺、肾、胸腺和法氏囊等所有受检组织均检出高病毒载量，表明QD25经肌内接种后可建立全身性感染；其中肝脏病毒载量显著高于其他组织（P < 0.01），关节组织病毒载量也相对较高，与感染鸡观察到的关节炎临床症状一致，提示QD25具有广泛组织嗜性且以肝脏为偏好器官，这与相应器官的大体病变和组织病理学变化相符。3.6 QD25感染鸡的组织病理学分析：感染后5 d的组织病理观察显示，阴性对照组肝小叶和肝索排列规则、中央静脉清晰、肝细胞完整，脾被膜完整、白髓与红髓分界清楚，肾皮质与髓质结构清晰、肾小球正常、肾小管上皮细胞完整；而QD25攻毒鸡肝脏结构紊乱，肝细胞明显肿胀和空泡变性，伴局灶性肝细胞坏死及门管区炎性细胞浸润，脾白髓与红髓界限模糊、白髓细胞明显减少、局灶坏死及炎性细胞浸润，肾小球毛细血管丛显著增大几近充满囊腔，肾小管上皮细胞肿胀、坏死和脱落导致管腔明显狭窄或闭塞；总体表明QD25感染引起全身性组织损伤，肝脏为主要靶器官，与QD25的广泛组织嗜性和器官内高病毒载量一致。
讨论部分指出，ARV全球分布、感染高度流行，可感染包括肉鸡和火鸡在内的多种禽类；本研究从山东关节炎肉鸡中分离的QD25经全基因组测序、系统发育分析和致病性评价证实为基因Ⅰ亚型重组株，与常用疫苗株遗传差异显著，对SPF鸡具有相当致病性，据研究人员所知这是基因Ⅰ亚型重组ARV毒株全基因组序列的首次报道。σC蛋白是ARV变异最大的蛋白，也是目前公认唯一介导型特异性中和免疫的病毒蛋白，被广泛用于基因分型；本研究σC系统发育分析显示QD25与以色列变异株ISR5225、ISR5215、美国田间株K1502030及中国基因Ⅰ亚型株2023ARV-GS-SDAU-1在基因Ⅰ型内形成独立亚分支，而疫苗株S1133位于另一亚分支；QD25与S1133的σC氨基酸同源性仅73.3%，与基因Ⅰ亚型以色列变异株约90%；田间株与疫苗株间广泛的氨基酸差异可能削弱交叉保护免疫，尽管具体阈值因病毒而异；σC基因内QD25与S1133存在87个差异残基，已有文献表明σC蛋白第210至246位氨基酸在通过分子相互作用诱导凋亡中起关键作用，该37个残基中S1133与QD25有8个不同，这些突变可能损害σC蛋白的凋亡诱导功能，从而促成QD25致病性和免疫逃逸特性的改变。由于仅基于σC基因的分类不足以识别潜在重组事件，全基因组测序对新发ARV田间株的准确表征至关重要；对全部10个节段的系统发育分析显示QD25发生了基因组重组，编码参与病毒RNA结合、基因组包装和病毒复制的σNS非结构蛋白的S4节段归入基因Ⅲ型，与一株σC基因亦属基因Ⅲ型的中国株聚在一起，而σC基因属基因Ⅰ亚型，证实QD25为自然跨基因型重组株，其S4节段可能来源于基因Ⅲ型；S4节段重组可能改变病毒复制效率、组织嗜性和致病性，越来越多的证据提示节段间重组是ARV进化的主要驱动力，可能导致能够逃逸疫苗诱导免疫应答的新变异株出现；QD25中发现的S4重组提示传统疫苗对此类变异株的效果可能较差，但这仍有待攻毒免疫试验证实；此外QD25与商业疫苗株S1133、1733和2408的σC基因核苷酸相似性均低于80%，进一步证实其与现用疫苗株的遗传差异。1日龄SPF鸡致病性评价显示，QD25感染导致显著体重下降和40%死亡率，死亡高峰在感染后5 d，剖检见肝脏肿胀和出血，与全身性病毒播散一致；RT-qPCR显示肝脏病毒载量最高，其次为关节组织；组织病理学检查显示多器官严重病变，包括肝脏结构紊乱、脾坏死及肾小管上皮细胞变性和坏死；这些结果表明QD25感染可诱导多系统损伤，其对肝脏和肌肉骨骼组织的嗜性与ARV特征性致病谱一致，高死亡率和严重组织病理学病变凸显了QD25的致病潜力及针对该变异株采取有效控制措施的紧迫性。研究人员进一步指出，虽然本研究未进行直接的疫苗交叉保护试验，但序列分析提供了有关商业疫苗对QD25潜在保护效力的有价值线索：QD25与疫苗株S1133在σC蛋白的氨基酸同源性仅73.3%，既往研究提示田间株与疫苗株氨基酸差异超过5%时交叉保护免疫可能显著受损；此外S4节段（编码σNS）的跨基因型重组可能改变病毒复制效率、组织嗜性或免疫逃逸能力，提示现有商业疫苗对QD25类基因Ⅰ亚型重组株可能保护有限，但仍需使用免疫鸡进行直接攻毒试验在未来研究中证实；虽然研究人员筛查了三种最常见的免疫抑制性病原（IBDV、FAdV-4和CIAV）以排除潜在共感染，未来研究中更广泛的病毒筛查 panel 将能更全面地排除共感染病原。研究结论为：本研究系统表征了从中国山东省临床关节炎肉鸡中分离的一株新型基因Ⅰ亚型ARV毒株QD25，据研究人员所知，这是基因Ⅰ亚型重组ARV毒株全基因组序列的首次报道；QD25在σC基因上存在广泛氨基酸变异，导致与经典疫苗株的氨基酸一致性低和显著抗原差异；系统发育分析揭示σC与S4基因进化谱系不一致，证实QD25为以基因Ⅰ亚型为骨架、S4节段来源于基因Ⅲ型的自然跨基因型重组株；致病性试验表明QD25对SPF鸡高度致病，引起生长迟缓和多器官损伤，具有对肝脏和肌肉骨骼组织的典型嗜性；这些发现提示持续的遗传突变和基因组重组驱动出现能够逃逸疫苗诱导免疫的新型高致病性ARV变异株，凸显了加强流行病学监测和及时更新中国ARV防控策略的紧迫需要。
