《Veterinary Microbiology》：Feline panleukopenia virus induces macrophage pyroptosis via activation of the ROS-NLRP3-Caspase-1 signaling axis
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猫泛白细胞减少症病毒（Feline panleukopenia virus，FPV）属于细小病毒科（Parvoviridae）原细小病毒属（Protoparvovirus），是引起猫泛白细胞减少症（feline panleukopenia）的病原体，该病是一种
猫泛白细胞减少症病毒（Feline panleukopenia virus，FPV）属于细小病毒科（Parvoviridae）原细小病毒属（Protoparvovirus），是引起猫泛白细胞减少症（feline panleukopenia）的病原体，该病是一种高度传染性且常致死的疾病，影响家猫和野生猫科动物。FPV感染以严重白细胞减少、肠道损伤和免疫抑制为特征，尤其在幼猫或未接种疫苗的猫中，急性暴发时死亡率高达90%。尽管疫苗接种计划广泛实施，全球仍时有散发性疫情暴发，对猫科动物健康构成持续威胁。虽然FPV的病毒学特性和流行病学特征已有充分记载，但FPV诱导免疫失调和宿主细胞损伤的分子机制仍知之甚少。先天免疫是宿主抵御病毒感染的第一道防线，巨噬细胞通过病原识别、细胞因子产生和启动炎症信号通路在协调抗病毒反应中发挥核心作用。在多种程序性细胞死亡形式中，焦亡（pyroptosis）已成为病毒感染与过度炎症相关联的关键机制。焦亡是一种溶解性且高度炎症性的细胞死亡形式，以细胞肿胀、质膜破裂和释放白细胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-18等促炎细胞因子为特征。该过程主要由含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）介导，尤其是Caspase-1，其在炎症小体组装后被激活。NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3（NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3，NLRP3）炎症小体是研究最充分的炎症小体复合物之一，作为细胞应激和病原刺激的关键传感器。激活后，NLRP3招募含有CARD的凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC），导致Caspase-1激活并随后将pro-IL-1β和pro-IL-18裂解为成熟形式。此外，活化的Caspase-1裂解gasdermin D（GSDMD），其N端片段在质膜上形成孔道，最终触发焦亡。越来越多的证据表明，包括流感病毒、人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）和严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）在内的多种病毒可通过激活NLRP3炎症小体诱导焦亡，从而同时促进抗病毒防御和病理性炎症。活性氧（reactive oxygen species，ROS）已被广泛认为是NLRP3炎症小体激活的重要上游调节因子。生理条件下，ROS以低水平产生并参与细胞信号传导过程。然而，过量ROS积累（通常与线粒体功能障碍相关）作为危险信号促进炎症小体组装。一个公认的机制涉及氧化应激下硫氧还蛋白相互作用蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）从硫氧还蛋白解离，随后与NLRP3结合，从而促进炎症小体激活。此外，线粒体损伤可导致线粒体DNA和其他损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）的释放，进一步放大炎症信号。尽管ROS-NLRP3轴已涉及多种感染性和炎症性疾病，但其在FPV诱导的免疫反应中的作用仍 largely 未知。细小病毒是小型的、无包膜的单链DNA病毒，编码能力有限，因此高度依赖宿主细胞机制进行复制。在FPV编码蛋白中，衣壳蛋白VP2是负责病毒进入、宿主特异性和抗原性的主要结构成分。越来越多的证据表明，病毒结构蛋白不仅仅是结构组分，还能主动调节宿主细胞过程，包括氧化应激和免疫信号通路。然而，FPV VP2是否参与诱导氧化应激及随后的炎症小体激活仍不清楚。基于这些观察，研究人员假设FPV感染通过ROS依赖的NLRP3炎症小体和Caspase-1信号通路激活诱导巨噬细胞焦亡，且病毒衣壳蛋白VP2可能作为氧化应激的上游触发因子。为验证该假设，研究人员在猫外周血单核细胞来源的巨噬细胞中建立了FPV感染模型，系统研究了焦亡特征、ROS产生、炎症小体激活以及VP2在线粒体功能障碍中的作用。该研究旨在为FPV诱导炎症的分子机制提供新见解，并确定潜在的治疗干预靶点。
一、研究背景与科学问题
猫泛白细胞减少症病毒（Feline panleukopenia virus，FPV）属于细小病毒科原细小病毒属，是引起猫泛白细胞减少症的病原体。该病是一种高度传染性且常致死的疾病，影响家猫和野生猫科动物，以严重白细胞减少、肠道损伤和免疫抑制为主要特征，急性暴发时死亡率可高达90%。尽管疫苗接种计划已广泛实施，全球范围内仍时有散发性疫情发生，对猫科动物健康构成持续威胁。然而，FPV诱导宿主免疫失调和细胞损伤的分子机制尚不清楚。
先天免疫是宿主抵御病毒感染的第一道防线，巨噬细胞在协调抗病毒反应中发挥核心作用。焦亡（pyroptosis）是一种溶解性且高度炎症性的程序性细胞死亡形式，以细胞肿胀、质膜破裂和促炎细胞因子释放为特征，主要由Caspase-1介导。NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3（NLRP3）炎症小体是研究最充分的炎症小体复合物之一，激活后招募ASC并导致Caspase-1活化，进而裂解gasdermin D（GSDMD）形成膜孔。活性氧（ROS）已被广泛认为是NLRP3炎症小体激活的重要上游调节因子，过量ROS积累与线粒体功能障碍相关，可作为危险信号促进炎症小体组装。尽管ROS-NLRP3轴已涉及多种感染性疾病，但其在FPV感染中的作用仍 largely 未知。此外，FPV衣壳蛋白VP2作为主要结构成分，是否参与诱导氧化应激及炎症小体激活尚不清楚。基于此，研究人员提出假设：FPV感染通过ROS依赖的NLRP3炎症小体和Caspase-1信号通路激活诱导巨噬细胞焦亡，VP2可能作为氧化应激的上游触发因子。
二、研究内容与结论
研究人员在猫外周血单核细胞来源的巨噬细胞中建立了FPV感染模型，系统研究了焦亡特征、ROS产生、炎症小体激活及VP2的作用。研究发现，FPV感染诱导巨噬细胞产生多种焦亡相关细胞变化，包括超微结构损伤、质膜完整性丧失、乳酸脱氢酶（LDH）释放增加、细胞死亡相关DNA损伤以及细胞内ROS积累。进一步研究表明，FPV感染显著增加Caspase-1、NLRP3、ASC、IL-18和IL-1β的mRNA表达水平，并促进GSDMD裂解产生GSDMD-N片段。使用ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）、NLRP3抑制剂MCC950和Caspase-1抑制剂YVAD-CHO进行药理学干预，均能显著减弱FPV诱导的焦亡反应，证实了ROS/NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号轴的functional参与。此外，VP2蛋白表达可诱导线粒体膜电位丧失和细胞内ROS积累，提示VP2可能作为FPV诱导氧化应激的上游因素。该研究揭示了FPV诱导巨噬细胞焦亡的分子机制，为理解FPV发病机制和寻找治疗干预靶点提供了新见解。
三、主要技术方法
该研究采用了多项关键技术方法：从长春持证供应商获取4-6月龄家猫外周血，使用SepMate?管结合Ficoll密度梯度离心分离外周血单核细胞（PBMCs）并分化为巨噬细胞，以感染复数（MOI）为1的FPV建立感染模型；采用间接免疫荧光试验（IFA）确认病毒感染；使用透射电子显微镜（TEM）观察焦亡相关超微结构变化；采用DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平；通过LDH细胞毒性检测试剂盒评估细胞膜完整性；使用TUNEL凋亡检测试剂盒评估DNA断裂；采用Western blot检测NLRP3、Cleaved-Caspase-1、pro-Caspase-1、GSDMD及GSDMD-N蛋白表达；使用ELISA试剂盒检测IL-1β、ASC、Caspase-1和NLRP3水平；通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测相关基因mRNA表达；使用NAC、YVAD-CHO和MCC950进行ROS、Caspase-1和NLRP3抑制实验；构建pcDNA3.1-VP2重组质粒并在人单核细胞白血病THP-1细胞中转染表达；采用JC-1试剂盒检测线粒体膜电位。
四、研究结果
3.1 FPV感染诱导猫巨噬细胞产生焦亡相关特征
通过间接免疫荧光试验确认FPV成功感染猫巨噬细胞并建立体外感染模型。透射电子显微镜显示FPV感染细胞出现明显超微结构损伤，包括细胞肿胀、质膜完整性破坏和细胞质结构紊乱。LDH活性在FPV感染巨噬细胞上清中显著增加，表明膜通透性增强和细胞损伤。TUNEL染色显示FPV感染巨噬细胞阳性染色显著增加，表明FPV感染诱导了大量与细胞死亡相关的DNA损伤。此外，FPV感染细胞表现出显著增强的ROS相关荧光，表明细胞内ROS积累增加。这些结果提供了FPV诱导炎性细胞死亡的表型证据。
3.2 FPV通过ROS-NLRP3-Caspase-1信号通路激活诱导巨噬细胞焦亡
RT-qPCR分析显示FPV感染后Caspase-1、NLRP3、ASC、IL-18和IL-1β的mRNA水平显著增加，且随感染时间延长而升高，72小时最为明显。Western blot显示GSDMD-N积累在FPV感染后24、48和72小时进行性增加。NAC预处理显著降低FPV感染巨噬细胞中ROS相关荧光。Western blot分析显示FPV感染显著增加NLRP3蛋白水平并增强Cleaved-Caspase-1和GSDMD-N的产生；NAC预处理减弱了FPV诱导的NLRP3、Cleaved-Caspase-1和GSDMD-N增加；MCC950处理降低了FPV诱导的Caspase-1裂解和GSDMD-N产生；YVAD-CHO抑制Caspase-1也显著减少GSDMD-N形成。LDH释放实验证实FPV感染导致细胞外LDH活性显著增加，而药理学抑制ROS、NLRP3或Caspase-1可减弱FPV诱导的膜损伤。这些发现证实ROS/NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号轴参与FPV诱导的猫巨噬细胞焦亡。
3.3 FPV VP2蛋白诱导氧化应激和线粒体功能障碍
Western blot验证了重组FPV VP2蛋白的表达。JC-1染色显示VP2处理细胞在24小时出现红色荧光显著减少伴绿色荧光增加，表明线粒体膜电位消散，提示VP2暴露诱导猫巨噬细胞线粒体功能障碍。转染pCDNA-VP2的细胞表现出显著增强的ROS相关荧光，而对照组和空载体组仅检测到微弱基础荧光，表明VP2表达促进细胞内ROS积累。这些结果提示VP2诱导的线粒体功能障碍可能在FPV感染期间促进ROS产生，参与FPV诱导焦亡的上游事件。
五、讨论与结论
讨论部分指出，焦亡在抗病毒免疫和免疫病理中发挥重要作用。病毒感染期间，焦亡可通过清除感染细胞促进病原体清除，但过度激活也可能导致失控的炎症反应和组织损伤。本研究证实FPV感染通过ROS/NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号轴诱导猫巨噬细胞焦亡。ROS积累作为NLRP3炎症小体激活的重要上游信号，NAC抑制ROS产生显著降低FPV诱导的NLRP3激活、Caspase-1裂解和GSDMD-N形成，证明ROS积累是上游调节因子而非仅仅是FPV感染的后果。NLRP3炎症小体作为先天免疫中枢平台，MCC950介导的NLRP3抑制显著抑制FPV诱导的Caspase-1激活和GSDMD-N产生。Caspase-1作为经典焦亡的核心执行者，YVAD-CHO抑制Caspase-1活性显著减少GSDMD-N产生并减弱FPV诱导的膜损伤。VP2作为FPV衣壳蛋白，其表达诱导线粒体膜电位丧失和细胞内ROS增加，提示VP2可能参与FPV感染期间的氧化应激。从致病角度，FPV诱导的巨噬细胞焦亡可能通过释放IL-1β和IL-18等炎性介质促进炎症放大和组织损伤，靶向ROS产生或炎症小体激活可能成为控制FPV感染相关过度炎症反应的潜在策略。
研究结论：该研究证明FPV感染通过激活ROS/NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路诱导巨噬细胞焦亡。FPV感染导致ROS积累增加、NLRP3炎症小体激活、Caspase-1裂解、GSDMD-N形成及随后的质膜完整性丧失。药理学抑制ROS、NLRP3或Caspase-1显著减弱FPV诱导的焦亡反应，证实该信号轴的功能参与。此外，FPV衣壳蛋白VP2被证明可诱导线粒体功能障碍并促进ROS产生，提示其可能在FPV感染期间对氧化应激作出贡献。这些发现为FPV诱导炎性细胞死亡的机制提供了新见解，并确定ROS/NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路为FPV发病机制的重要介导因素。
