衰老重塑肺再生中祖细胞与微环境互作

《Frontiers in Aging》：Aging remodels progenitor and niche interactions in lung regeneration

　　

摘要 引言： 衰老组织中祖细胞的微环境发生变化，可能影响其在再生过程中的功能。尽管近年来对成体肺祖细胞的理解有所进展，但衰老对这些细胞的影响仍不清楚。 方法： 为分析衰老改变，研究人员使用了18–24月龄的老年野生型小鼠以及表现出加速衰老表型的Zmpste24–/–缺陷小鼠。采用三维类器官培养体系评估体外再生能力。此外，分离细胞并用衰老和自噬标志物进行鉴定。 结果： 研究结果发现，来自老年小鼠和Zmpste24–/–小鼠的肺上皮细胞保留了形成类器官的潜力，通过增强自噬相关的转录反应（尤其是与年轻成纤维细胞共培养时）维持其表型和细胞稳态。此外，这些祖细胞在衰老过程中可能表现出对机械应力敏感性增加，这可能与核纤层蛋白减少和Zmpste24缺陷有关。这种脆弱性通过荧光激活细胞分选（FACS）得以体现，该过程可进一步损害其再生潜力。相比之下，来自Zmpste24–/–小鼠的培养成纤维细胞表现出核缺陷并获得衰老表型，其特征为雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）激活和自噬降低，进而损害类器官的形成。 讨论： 研究结果表明，在衰老过程中，祖细胞及其成纤维细胞微环境整合了塑造细胞间相互作用的微环境信号，而这些相互作用对于肺再生至关重要。

研究背景

衰老表型与有限的再生能力相关，这主要归因于干细胞耗竭。肺属于低更新率器官，其再生依赖于稀有干细胞和兼性祖细胞的活性。在气道上皮中，基底细胞是负责再生的稀有干细胞；而在肺泡区域，再生主要由兼性祖细胞介导，特别是肺泡II型上皮细胞（AT2）的一个亚群，它们通过与由成纤维细胞构成的单细胞微环境相互作用来恢复肺泡结构。细胞间的相互作用影响着细胞命运决定。因此，确定与衰老相关的改变是否会阻碍肺再生并促进干细胞耗竭至关重要。

目前，关于成体肺干细胞的研究虽有进展，但衰老对其功能的影响在很大程度上仍是未知。为解决这一空白，研究人员比较了生理性衰老和加速性衰老，使用了Zmpste24缺陷小鼠（早衰模型）、生理性衰老的野生型小鼠以及年轻野生型小鼠作为对照。Zmpste24是一种对核纤层蛋白A/C加工至关重要的金属蛋白酶，其缺陷小鼠在16周龄后会出现早衰特征。López-Otín等人提出，在衰老的标志中，干细胞耗竭和细胞间通讯改变是关键决定因素。其中，自噬缺陷尤为关键，因为它会损害干细胞的功能和存活。在衰老背景下，自噬通过维持干细胞功能和活力来防止细胞衰老并促进再生，而mTOR通路则作为中心调节器，以组织特异性的方式调节干细胞潜能。因此，本研究旨在确定核膜完整性、自噬、细胞衰老以及成纤维细胞微环境的年龄相关性改变是否会导致肺祖细胞耗竭和再生能力下降。

研究方法概述

研究人员采用了多种关键技术方法：使用18–24月龄生理性衰老的C57BL/6J野生型小鼠和16周龄以上的Zmpste24^?/?加速衰老小鼠模型；通过磁珠分选（MACS）从肺组织中分离CD326（EpCAM⁺）上皮细胞和成纤维细胞，并与流式细胞分选（FACS）进行比较；建立三维肺类器官共培养体系评估再生能力；运用实时定量PCR（RT-qPCR）和自噬相关基因PCR阵列分析基因表达；采用免疫荧光和免疫印迹检测核纤层蛋白、自噬标志物（LC3、p62）及mTORC1通路（pS6）等蛋白水平；通过衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色评估细胞衰老状态。

研究结果

1. 祖细胞上皮细胞在生理性和加速性衰老过程中保留体外再生潜力

为评估肺再生能力，研究人员将经MACS分选的EpCAM⁺上皮细胞与来自年轻野生型小鼠的预培养成纤维细胞共培养形成类器官。结果显示，来自两种衰老模型（老年WT和Zmpste24^?/?）的分离上皮细胞在与年轻成纤维细胞共培养时，形成的类器官数量和大小与年轻小鼠相当。类器官在14天和28天后分别表达SPC、HOPX和T1α等标志物，证实了AT2向AT1的分化。

2. 荧光激活细胞分选（FACS）削弱肺上皮类器官形成潜力

研究发现，在MACS之后额外增加FACS分选步骤会显著延长处理时间并使细胞暴露于剪切力。FACS处理后，年轻细胞中γH2AX（DNA损伤标志物）水平升高，而衰老细胞基线γH2AX水平更高且分选后趋于上升。额外FACS分选显著降低了所有条件下的类器官生长，且在衰老细胞中效果更为明显。MACS单独使用即可获得>85%的纯度。

3. 生理性和加速性肺衰老过程中核纤层蛋白丢失

通过免疫荧光和免疫印迹分析，研究人员发现老年WT和Zmpste24^?/?小鼠肺组织中的核纤层蛋白A/C和B1水平显著低于年轻小鼠，且这种下降随年龄增长呈渐进性。核纤层蛋白的减少可能损害核力学特性，增加细胞对机械应力的敏感性。

4. 衰老上皮细胞通过自噬相关转录反应维持稳态

对新鲜分离的EpCAM⁺细胞进行的84个自噬相关基因PCR阵列分析显示，老年WT和Zmpste24^?/?小鼠的上皮细胞聚为一类，与年轻细胞分开。差异表达分析表明，Zmpste24^?/?细胞中多个自噬相关基因（如LC3、Atg12、Atg3、Lamp1）上调，而自噬负调控因子Akt1下调。同时，p53和Cdkn1a（衰老标志物）的表达在组间无显著差异，提示衰老上皮细胞主要通过激活自噬途径而非进入衰老状态来维持稳态。

5. 衰老微环境限制肺类器官生长

当将来自年轻WT或Zmpste24^?/?的上皮细胞与来自Zmpste24^?/?的成纤维细胞共培养时，两者形成的类器官数量均较少且体积较小。对成纤维细胞的表征显示，老年WT和Zmpste24^?/?成纤维细胞核变形（如核泡）显著增多。Zmpste24^?/?成纤维细胞表现出SA-β-gal阳性率升高、mTORC1通路激活（pS6水平升高）以及自噬通量降低（氯喹处理后LC3-II和p62积累模式改变）。短时间雷帕霉素处理未能逆转其衰老表型。此外，通过饥饿加氯喹处理诱导年轻WT成纤维细胞mTORC1活化后，其支持类器官形成的能力也受到抑制，且形成的类器官中出现衰老细胞。

讨论与结论

研究表明，衰老会增加慢性阻塞性肺疾病和特发性肺纤维化等呼吸系统疾病的发病率和死亡率，其促成因素包括干细胞耗竭和细胞间通讯改变。本研究利用老年野生型小鼠和Zmpste24^?/?加速衰老模型，发现肺上皮细胞在衰老过程中保留了再生能力，并未进入衰老状态，而是通过上调自噬相关转录反应来维持细胞稳态。研究人员推测这可能是一种适应性机制，使自噬有助于维持干细胞稳态。然而，由于无法直接评估自噬通量，这是本研究的局限性之一。

研究还发现，核纤层蛋白A/C和B1在肺衰老过程中进行性减少，这增加了细胞对机械应力的易感性。FACS分选带来的额外机械应力加剧了这一脆弱性，导致衰老细胞类器官形成能力更差，这解释了为何其他使用FACS的研究观察到衰老上皮细胞形成类器官能力下降。相比之下，MACS分选能更好地保持类器官形成能力。

关键发现是，衰老的成纤维细胞微环境（而非上皮细胞本身）是限制再生的主要因素。来自老年和Zmpste24^?/?小鼠的成纤维细胞表现出核缺陷、衰老表型、mTORC1持续激活和自噬降低。当这些衰老成纤维细胞与上皮细胞共培养时，严重损害类器官形成。诱导年轻成纤维细胞mTORC1活化也能模拟这一抑制效应。

综上所述，研究结果支持祖细胞与其微环境之间存在密切的相互作用，微环境信号协调自噬驱动的应激反应以促进再生。衰老导致核纤层蛋白丢失增加上皮细胞对机械应力的敏感性，而成纤维细胞微环境则通过mTORC1激活和自噬受损获得衰老表型，从而限制再生能力。理解这些细胞在衰老过程中丧失功能的机制，将为各种呼吸系统疾病的病理生理学提供更深入的见解。