《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Microfluidic fabrication of lipid-coated PLGA nanoparticles co-delivering CuS and curcumin for combined chemo-photothermal therapy
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摘要专业翻译
宫颈癌仍然是一项重大的全球健康挑战，化疗是其主要治疗手段之一。然而，其临床疗效常因全身毒性、药物溶解性差和靶向性不足而受到影响。为解决上述局限性，研究人员报道了利用微流控涡旋混合器制备共递送姜黄素（Cur）和硫化铜（CuS）的脂质包被聚乳酸-羟基
摘要专业翻译
宫颈癌仍然是一项重大的全球健康挑战，化疗是其主要治疗手段之一。然而，其临床疗效常因全身毒性、药物溶解性差和靶向性不足而受到影响。为解决上述局限性，研究人员报道了利用微流控涡旋混合器制备共递送姜黄素（Cur）和硫化铜（CuS）的脂质包被聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米颗粒（NPs），用于化学-光热联合治疗。该微流控平台能够实现可控、可重复的纳米颗粒制备，具有低多分散指数（PDI）和两种化合物的高共包封效率。本研究的主要创新点在于将PLGA-脂质杂化结构与模型抗癌药物Cur和近红外（NIR）响应光热剂CuS的同时包封整合到单一制剂中。通过对流速比（FRR）和总流速（TFR）的优化，实现了对粒径和理化性质的精确调控。CuS/Cur@PLGA@Lipid NPs将PLGA核心的持续药物释放与脂质壳层提供的改善胶体稳定性和细胞摄取相结合。体外评估表明其具有pH敏感性释放特性，在酸性微环境下Cur的释放较生理条件加速。此外，该纳米颗粒对宫颈癌细胞（HeLa）表现出显著的细胞毒性，且在近红外激光照射下通过CuS驱动的光热消融作用其毒性进一步增强。定量荧光和流式细胞术分析证实，与游离Cur相比，该纳米颗粒具有优异的细胞摄取和胞内滞留能力，而多细胞肿瘤球模型则证明了其增强的三维抗肿瘤效果。总体而言，本研究为具有双重化学-光热治疗潜力的脂质包被PLGA纳米颗粒的高通量生产提供了体外概念验证。
论文解读
一、研究背景与意义
宫颈癌是妇科恶性肿瘤中第三大死亡原因，每年约有13,000例新发浸润性宫颈癌病例，死亡率接近30%。尽管其主要由持续性高危人乳头瘤病毒（HPV）感染引起，但宫颈癌仍是全球第四大常见女性癌症，严重威胁中低收入地区女性的健康。化疗是宫颈癌的常用治疗手段，然而传统化疗药物存在溶解性差、稳定性不足和体内清除迅速等问题，导致药物在肿瘤部位蓄积不足并产生全身毒性及短期和/或长期副作用。纳米药物递送系统（NDDSs）可通过增强渗透与滞留（EPR）效应在肿瘤组织中被动蓄积，为改善肿瘤特异性递送提供了策略。姜黄素（Cur）是从姜黄根茎中提取的疏水性多酚，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒和抗肿瘤等多种药理活性，但其临床应用受限于生物利用度低和代谢迅速。PLGA是一种可生物降解的共聚物，因其可控的降解速率和可塑性被广泛应用于药物递送系统。外层脂质包被（由磷脂和胆固醇组成）可显著改善胶体稳定性、增强细胞膜亲和力、促进细胞摄取并利于内体逃逸。硫化铜（CuS）纳米颗粒因其强近红外（NIR）吸收、有效的NIR响应光热加热和良好的生物相容性，被选为光热剂。已有研究表明，在治疗浓度下，CuS NPs可在酸性肿瘤微环境中逐渐生物降解为铜离子，并通过机体代谢途径清除，从而最大限度降低长期蓄积和毒性风险。本研究旨在开发一种集微流控制备、脂质包被PLGA纳米平台、Cur和CuS双载荷包封、NIR响应性于一体的多功能策略，以实现化学-光热联合治疗。
二、研究内容与主要结论
研究人员利用自行开发的微流控涡旋混合器，通过系统调控总流速（TFR）和流速比（FRR），实现了对纳米颗粒粒径和低多分散指数（PDI）的精确控制，并具有高通量和可扩展性潜力。研究优化了PLGA NPs、脂质NPs和Cur@PLGA NPs的制备条件，最终构建了CuS/Cur@PLGA@Lipid NPs。优化后的纳米颗粒粒径约为115–130 nm，PDI低于0.2，具有高姜黄素包封效率和pH依赖性释放行为。体外实验表明，该纳米颗粒对HeLa宫颈癌细胞表现出显著细胞毒性，且在NIR激光照射下通过CuS介导的光热消融作用进一步增强。多细胞肿瘤球（MCTS）模型证实了其增强的三维抗肿瘤效果。该研究为微流控高通量制备多功能纳米平台用于联合癌症治疗提供了体外概念验证。
三、关键技术与方法
研究人员采用的主要关键技术方法包括：1）微流控涡旋混合技术，通过调控FRR和TFR实现纳米颗粒的精确制备；2）动态光散射（DLS）表征技术，用于测定粒径、PDI和ζ电位；3）紫外-可见分光光度法，用于评估药物包封效率（EE）和载药量（LC）；4）透析法进行体外药物释放研究，并采用零级、一级、Higuchi和Korsmeyer–Peppas动力学模型拟合释放机制；5）MTT比色法评估细胞毒性，结合980 nm NIR激光照射评估光热效应；6）荧光显微镜和流式细胞术定量分析细胞摄取效率；7）三维多细胞肿瘤球模型评估抗肿瘤效果。细胞实验采用人包皮成纤维细胞（HFF-1）和HeLa宫颈癌细胞系。
四、研究结果
4.1 PLGA NPs的合成与表征
通过系统考察FRR、TFR、PLGA浓度和Cur浓度对纳米颗粒理化性质的影响，发现FRR为1:3时粒径最小且PDI较低；TFR从5增至60 mL/min时粒径从约130 nm逐渐减小至约60 nm；PLGA浓度从2.5增至20 mg/mL时粒径从约50 nm增至约130 nm，PDI仍低于0.2。优化条件为FRR 1:3、TFR 15 mL/min。
4.2 脂质NPs的合成与表征
TFR对脂质NPs粒径有显著影响，TFR增加使粒径减小；FRR为3:1和4:1时粒径最小。ζ电位在各条件下保持负值且波动极小，表明表面电荷稳定。
4.3 Cur@PLGA NPs的合成与表征
FRR为1:3时粒径最小且PDI较低，ζ电位为?30 mV，确保颗粒间排斥力并防止聚集。TFR为15 mL/min时粒径小且PDI低，ζ电位稳定在?30 mV。
4.4 功能化脂质纳米颗粒的结构演变与尺寸表征
空白脂质NPs粒径约85 nm；Cur@PLGA NPs粒径约79 nm；脂质包被后Cur@PLGA@Lipid NPs粒径增至约115 nm；加入CuS后CuS/Cur@PLGA@Lipid NPs粒径进一步增至约120 nm。脂质包被后的粒径增加反映的是混合磷脂/胆固醇界面层及水化效应，而非单一磷脂双分子层厚度。
4.5 PLGA基NPs的表征：稳定性、光热响应、pH敏感性药物释放及光热性能
Cur的包封效率和载药量显著高于CuS。粒径从PLGA NPs约50 nm逐步增至完全载药和包被后约130 nm，PDI始终低于0.2。ζ电位从约?20 mV增至?35 mV，表明静电排斥增强。透射电子显微镜（TEM）证实了脂质包被结构和CuS颗粒的存在。在4°C和37°C条件下储存1个月，粒径和PDI变化极小，表明物理稳定性良好。紫外-可见吸收光谱在约420 nm和980 nm处出现特征峰，分别确认了Cur和CuS的成功包封。pH依赖性释放研究表明，酸性pH 5.5条件下Cur释放显著高于并快于生理pH 7.4，脂质包被起到有效扩散屏障作用。释放动力学拟合显示Korsmeyer–Peppas模型拟合最佳（pH 7.4时R2=0.992，pH 5.5时R2=1.000），释放指数n分别为0.115和0.281，表明Cur释放主要由Fickian扩散主导。傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析确认各组分通过物理相互作用结合而非共价键合，药物在包封后保持化学完整性。光热性能研究表明，在1.0 W/cm2功率密度下照射300 s，温度可超过50°C，超过热疗阈值；0.1 mg/mL CuS浓度为平衡治疗效果和安全性的最优浓度；重复开关激光循环中温度波动一致，表明光热稳定性良好。
4.6 体外细胞毒性
在HFF-1成纤维细胞中，CuS NPs、Cur@PLGA NPs和Cur@PLGA@Lipid NPs在非照射条件下均表现出可接受的细胞相容性，细胞活力始终超过85%。在HeLa细胞中，CuS/Cur@PLGA@Lipid NPs联合激光照射组表现出最强的细胞毒性，在较高浓度下达到最低细胞活力。活/死细胞染色实验进一步证实，CuS/Cur@PLGA@Lipid NPs联合NIR照射组表现出最强烈的红色荧光和最高水平的细胞死亡，凸显了CuS的光热消融增强效应。
4.7 细胞摄取实验
荧光显微镜和流式细胞术分析表明，CuS/Cur@PLGA@Lipid NPs在各时间点均表现出显著高于游离Cur组的荧光强度，尤其在6、12和24 h时差异最为显著。对照实验确认荧光信号特异来源于Cur而非CuS干扰，验证了脂质包被配方增强了药物胞内蓄积。
4.8 肿瘤球分析
在三维多细胞肿瘤球模型中，未处理组和CuS组在整个实验期间保持完整致密的球体结构；Cur和Cur@PLGA NPs组表现出明显毒性效应；Cur@PLGA@Lipid组显示球体结构严重破坏；CuS/Cur@PLGA@Lipid NPs联合激光组表现出最显著的球体降解和细胞死亡，与二维单层实验结果一致。
五、讨论与结论
讨论部分指出，涡旋型微流控混合器通过促进有机相和水相之间的快速对流混合和界面传输，加速溶剂交换并建立相对均匀的过饱和状态，有利于快速成核并减少不可控的颗粒生长。研究将微流控平台扩展至包含Cur和CuS的多功能PLGA-脂质制剂，但未进行雷诺数、混合时间、计算流体动力学（CFD）分析及与批量纳米沉淀或其他微流控混合器的直接比较。脂质包被引起的粒径增加和ζ电位变化支持脂质相关表面层的形成，但现有数据无法直接确定均匀脂质双分子层及其厚度。Cur释放行为的变化可能源于脂质层引起的界面水化、基质可及性和转运途径的改变，但数据无法定量区分药物扩散、聚合物降解和基质结构变化各自的贡献。脂质包被配方增强的胞内蓄积可能源于纳米颗粒-细胞相互作用的改变，但具体内吞途径未被确定。NIR照射增强的细胞毒性支持化学-光热联合效应，但未建立特定分子机制或定量协同相互作用。光热转换效率未计算，光热性能仅基于温度升高和照射稳定性评估。三维肿瘤球实验评估了整体形态和结构破坏，但未进行定量纳米颗粒穿透深度分析。研究局限性包括：未进行TEM-EDS/STEM-EDS元素图谱、X射线光电子能谱（XPS）和电感耦合等离子体（ICP）分析以确认CuS在纳米颗粒架构中的精确空间定位；未研究血清稳定性和蛋白冠形成；仅使用单一癌细胞系；未在正常HFF-1成纤维细胞中评估完整配方的光热毒性；定量混合表征、长时间高通量制造、批次间重现性、特异性内吞机制和定量球体穿透均超出本研究范围。
研究结论指出，本研究利用微流控涡旋混合方法制备了CuS/Cur@PLGA@Lipid NPs用于化学-光热联合治疗。优化后的纳米颗粒粒径约115–130 nm，PDI低于0.2，具有高姜黄素包封效率和pH依赖性释放行为。在pH 7.4条件下96 h内释放约75%–80%的包封姜黄素，酸性条件（pH 5.5）下释放加速。该纳米颗粒对HeLa细胞表现出增强的细胞毒性，且在NIR照射下通过CuS介导的光热加热进一步增加。该制剂还表现出良好的物理/胶体储存稳定性和重复照射循环下的稳定光热性能。微流控平台为多功能纳米颗粒的可控制备提供了有前景的途径，并具有高通量生产的潜在优势。磷脂/胆固醇相关表面层可能为修饰PLGA NPs界面性质提供了一种替代传统PEG化的策略。总体而言，本研究证明了将微流控制备、脂质相关表面修饰、姜黄素递送和CuS介导的光热治疗整合到单一多功能纳米平台的可行性。尽管增强的体外化学-光热细胞毒性和良好的理化性质支持该平台在联合癌症治疗中的潜力，但仍需使用更多癌症模型、正常细胞和体内系统进行进一步研究，以验证其治疗功效、安全性和转化潜力。
