胶质母细胞瘤中共享的血管-缺氧转录程序与免疫组织结构的关联研究

《Frontiers in Immunology》：A shared vascular-hypoxic transcriptional program is associated with immune organization in glioblastoma

摘要专业翻译 胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）包含空间上彼此独立的血管相关区域和缺氧/坏死相关区域，但这些经典解剖区域在多大程度上共享将血管重塑与免疫相关过程联系起来的转录程序，目前仍未完全阐明。本研究将Ivy胶质母细胞瘤图谱计划（Ivy Glioblastoma Atlas Project, IvyGAP）的解剖区域转录组数据作为发现框架，并与独立的批量及单细胞转录组资源进行整合，以表征共享的血管-缺氧程序的细胞、免疫及临床背景。对区域定义的IvyGAP分区进行分析，研究人员鉴定出1,114个在血管相关区域富集的基因和403个在缺氧/坏死相关区域富集的基因，其中95个基因在两个比较中共享。功能富集分析提示这些基因涉及血管生成、细胞外基质重塑、炎症信号传导、趋化作用、补体/凝血及细胞因子相关过程。共享特征进一步被解析为血管生成与血管重塑、免疫与炎症信号传导，以及共享的免疫血管基因亚组。单细胞图谱显示这些程序在内皮细胞、血管周围细胞和髓系细胞群中均有表达，其中免疫/炎症组分在血管相关细胞群中也可检测到。血管重塑基因与炎症基因、基质评分和免疫排斥评分、髓系富集免疫细胞群及免疫调节标志物呈正相关。来自各功能亚组的代表性基因在TCGA和CGGA队列中均显示在间充质型GBM中优先表达，而使用预定义的组合免疫血管程序进行的生存建模在三个GBM队列中将患者分为总生存期显著不同的组别。综上，这些发现确定了一个以解剖学为基础的血管-缺氧转录程序，该程序与血管重塑、炎症信号传导、免疫背景特征及不良临床结局相关，为解读GBM中免疫血管关系提供了一个跨数据集框架。

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一、研究背景与科学问题

胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）是成人中最具侵袭性的原发性脑恶性肿瘤，其突出的特征是显著的空间异质性——血管重塑、缺氧、坏死和免疫功能障碍在肿瘤内分布不均。这些区域形成了解剖上彼此独立但在生物学上相互关联的微环境，包括富含异常血管结构的区域、缺氧和坏死区域、假栅栏状肿瘤细胞聚集区以及浸润边缘。微血管增殖和坏死是GBM的核心组织病理学标志，反映了血管功能障碍、缺氧与肿瘤适应之间的密切关系。

GBM的免疫微环境以髓系细胞为主，包括脑驻留小胶质细胞和浸润的单核细胞来源巨噬细胞，而淋巴细胞通常较少。免疫细胞组成在不同解剖区域间存在差异：血液来源的巨噬细胞富集于血管周围和坏死区域，而缺氧微环境可以隔离并功能重编程肿瘤相关巨噬细胞和细胞毒性T细胞。

尽管血管区域和缺氧/坏死区域在生物学上相互关联，但既往研究往往通过不同的生物学框架来研究它们：血管区域主要被视为血管生成和屏障功能障碍的场所，而缺氧或坏死周围区域则在代谢应激、治疗抵抗和免疫抑制信号传导的背景下被研究。近年来的机制研究日益表明这些区域与免疫微环境之间存在双向关系：GBM相关内皮细胞可通过血管分泌信号促进免疫调节性巨噬细胞状态，而缺氧相关巨噬细胞群可改变内皮完整性和血管通透性。

然而，一个尚未解决的关键问题是：血管相关区域和缺氧/坏死相关区域是否共享一个明确的转录程序，该程序能够整合血管重塑和免疫相关特征？这样一个跨组织学不同微环境的转录程序可能揭示出仅通过分区特异性分析无法捕捉的共享微环境状态，并为将血管重塑与免疫背景和临床行为联系起来提供框架。因此，研究人员开展了本研究，以确定GBM中是否存在这样一个共享的血管-缺氧转录程序，并系统表征其细胞、免疫和临床背景。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员采用整合性解剖转录组学方法开展研究。首先，使用IvyGAP的区域注释RNA-seq数据作为发现框架：将增生血管和微血管增殖（HBV/MVP）区域作为血管相关区域，坏死周围带和坏死周围假栅栏状细胞（PNZ/PAN）作为缺氧/坏死相关区域，以浸润边缘、浸润肿瘤和富细胞肿瘤区域（LE/IT/CT）作为参考区域，分别进行差异表达分析，取两组富集基因的交集定义共享的血管-缺氧特征。功能富集分析使用Gene Ontology Biological Process和KEGG通路注释（ShinyGO v0.80），蛋白功能关联分析使用STRING数据库。随后，利用公开的UCSC Cell Browser单细胞数据集（包括富集内皮和血管周围细胞的GBM单细胞数据集以及独立的大脑血管参考数据集）进行单细胞图谱映射。免疫背景关联分析使用TIMER3和GSCA平台计算Spearman相关性。GBM亚型相关表达模式使用GlioVis平台在TCGA-GBM和CGGA队列中评估。生存分析使用SurvExpress和GEPIA2平台，在TCGA-GBM、Gravendeel GSE16011和Lee/Nelson GSE13041三个独立GBM队列中进行。

三、研究结果

3.1 IvyGAP鉴定出富集重塑和免疫相关过程的共享血管-缺氧转录程序

对IvyGAP区域注释数据的分析显示，HBV/MVP区域与参考区域相比鉴定出1,114个富集基因，PNZ/PAN区域鉴定出403个富集基因，两组基因的交集包含95个基因，被定义为共享的血管-缺氧特征。该特征在IvyGAP解剖结构中的投影确认其在血管和缺氧/坏死相关区域中优先表达。功能富集分析表明该共享特征涵盖组织重塑和免疫相关过程：KEGG分析鉴定出IL-17、TNF、NF-κB、细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号传导、补体和凝血级联、吞噬体、ECM-受体相互作用、黏着斑和癌症蛋白聚糖等通路的富集；Gene Ontology Biological Process分析显示趋化作用、血管生成、伤口愈合、血管形态发生和发育、炎症反应以及细胞迁移和运动调节等条目的富集。STRING分析鉴定出与细胞外基质相互作用、胶原结合、整合素介导的细胞表面相互作用、中性粒细胞趋化、炎症信号传导和TLR4相关反应相关的功能模块。进一步根据功能注释将95个基因分为三个功能亚组：血管生成和血管重塑基因、免疫和炎症信号传导基因，以及共享的免疫血管基因。所有三个功能亚组在HBV、MVP、PNZ和PAN区域中相对于LE、IT和CT区域均显示优先表达。

3.2 单细胞图谱和免疫背景分析将三个功能基因亚组与内皮-血管周围区域、髓系细胞群和免疫调节特征相关联

在富集内皮和血管周围细胞的GBM单细胞数据集中，血管生成和血管重塑基因在内皮细胞、周细胞和平滑肌细胞中显著表达，在成纤维样细胞群和小胶质细胞/巨噬细胞中也有信号。免疫和炎症信号传导基因在髓系细胞群（特别是小胶质细胞/巨噬细胞和中性粒细胞）中最强检测到，但在内皮细胞、周细胞、平滑肌细胞和成纤维样细胞等血管相关区域中也可检测到。共享免疫血管基因在内皮、血管周围基质、髓系以及部分恶性或干细胞样区域中广泛表达。在独立的大脑血管单细胞参考数据集中观察到类似的分布模式。

免疫背景关联分析显示，血管生成和血管重塑基因与免疫和炎症信号传导基因（包括细胞因子、趋化因子和髓系相关介质）广泛正相关。多个血管生成和血管重塑基因与基质评分和免疫排斥评分正相关，而与整体免疫评分的关联较为多变。与推断免疫细胞群的关联分析显示，血管生成和血管重塑基因评分与单核细胞、巨噬细胞、Th17细胞、自然杀伤T细胞、调节性T细胞群和细胞毒性细胞正相关，与B细胞、CD8+初始细胞和γδ T细胞负相关。血管重塑基因与检查点/T细胞功能障碍标志物（CD274、PDCD1LG2、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4）、免疫抑制性细胞因子信号传导标志物（TGFB1、TGFB2、IL10）和髓系免疫调节标志物（CSF1R、CD163、MRC1、MSR1、LGALS9、IDO1）主要呈正相关。单细胞图谱显示检查点/T细胞功能障碍标志物主要在小胶质细胞/巨噬细胞和T细胞中检测到，免疫抑制性细胞因子信号传导标志物在周细胞、小胶质细胞/巨噬细胞、内皮细胞和其他基质细胞群中广泛分布，而髓系免疫调节标志物在小胶质细胞/巨噬细胞中强烈富集。三个免疫调节标志物评分在间充质肿瘤中均显著高于经典型和前神经元型肿瘤，但与EGFR扩增状态无显著关联。

3.3 选定的功能基因亚组与间充质GBM身份和不良临床结局相关

在TCGA-GBM RNA-seq队列中，各功能亚组中富集程度最高的基因——血管生成和血管重塑基因（LOX、CAV1、FN1）、免疫和炎症信号传导基因（S100A9、TNFAIP6、S100A8）和共享免疫血管基因（SERPINE1、PTGS2、THBS1）——均显示在间充质GBM中优先表达。在独立CGGA队列中观察到广泛一致的间充质相关表达模式。

生存分析中，将三个功能基因亚组作为预定义的多基因集在SurvExpress中分析，在TCGA-GBM、Gravendeel GSE16011和Lee/Nelson GSE13041三个队列中均将患者分为总生存期显著不同的高风险和低风险组，高风险组总生存期显著缩短。亚型分层分析显示，在间充质GBM中，高血管生成和血管重塑特征表达与较短总生存期相关（HR=2.4, p=0.0073），高共享免疫血管特征表达也与较短总生存期相关（HR=1.9, p=0.048），而免疫和炎症信号传导亚组显示一致但未达显著性的趋势（HR=1.7, p=0.073）。在经典型和前神经元型肿瘤中未观察到明确的生存分离。

四、讨论与结论

研究人员指出，本研究鉴定的共享血管-缺氧转录程序将血管重塑、炎症信号传导和免疫相关特征整合在GBM两个解剖上不同的肿瘤微环境中。该程序为经典组织病理学结构与近年高分辨率空间图谱所解析的多细胞微环境之间提供了分子联系。研究结果与近期机制研究一致：间充质样内皮细胞通过TWIST1/SATB1/骨桥蛋白程序形成免疫抑制性血管微环境，而缺氧相关单核细胞来源巨噬细胞通过肾上腺髓质素信号传导破坏内皮黏附连接。基质重塑可能是连接血管病理与免疫排斥的额外环节。

关于临床转化意义，尽管血管正常化为联合策略提供了生物学依据，但免疫检查点抑制剂在未经选择的GBM人群中疗效有限。多项临床试验（CheckMate 143、CheckMate 498、CheckMate 548等）未显示生存获益。因此，该血管-缺氧程序不应被解释为治疗预测性生物标志物，但为未来测试免疫血管和基质状态是否可分层血管-免疫联合策略的应答提供了候选框架。

研究局限性包括：基于公开可用的转录组数据集，分析受限于各平台的分辨率、注释和样本组成；缺乏机构内部验证队列；需要额外的空间转录组学、多重组织分析和功能研究来解析患者特异的细胞相互作用。

研究结论：血管和缺氧/坏死相关的GBM微环境共享一个免疫血管重塑状态。通过将血管生成和血管功能障碍与缺氧应激、基质重塑、髓系免疫调节和免疫排斥相关特征联系起来，该框架补充了近期空间和机制研究，并定义了一个可在临床注释的GBM样本中进行未来空间验证和功能扰动的可检验程序。