麻风树来源的curcusones B和C抑制恶性疟原虫并对晚期环状体和早期滋养体阶段具有优先活性

《Frontiers in Malaria》：Jatropha curcas-derived curcusones B and C inhibit Plasmodium falciparum with preferential activity against late-ring and early-trophozoite stages

　　

摘要 引言： 疟疾在全球许多热带和亚热带地区仍然是一个重大的健康威胁，包括撒哈拉以南非洲、南亚和东南亚、拉丁美洲以及大洋洲部分地区。虽然撒哈拉以南非洲仍然承担着最高的病例和死亡负担，但其他流行区域也面临着持续的传播和诸如耐药性寄生虫等挑战。这种全球分布强调了探索替代治疗方法和预防策略以有效对抗该疾病的必要性。本研究采用生物引导的方法来识别和优先从麻风树（Jatropha curcas）中筛选能够抑制疟原虫的天然化学型，重点关注其药效动力学作用。化合物通过柱层析分离，结构通过核磁共振（NMR）和质谱（MS）进行分析。 方法： 研究人员使用SYBR Green法对氯喹敏感（Pf3D7）和多药耐药（PfDd2）的恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）株系筛选了提取物、组分和分离的化合物，同时通过基于刃天青的测定法评估了对正常Vero细胞系的选择性。研究人员利用集成流式细胞术，辅以吉姆萨染色显微镜检查，评估了活性化合物的无性血液阶段特异性和杀灭动力学。 结果： 结果显示，麻风树的乙醇根提取物在初步筛选中对PfDd2和Pf3D7株系均表现出中等但选择性的抗疟原虫效力，半数抑制浓度（IC50）值分别为21.87和24.82 μg/mL。随后的液-液分配产生了效力提高的组分，IC50值范围为11.24至34.15 μg/mL。对活性组分的生物测定指导纯化导致了十二种已知化合物（1–12）的分离。这些分离物的体外评估显示，curcusone B（5）和curcusone C（6）对PfDd2和Pf3D7株系均具有强效的抗疟原虫活性，IC50值范围为0.63至1.24 μM。Vero细胞毒性试验显示，这两种最活跃的化合物选择性适中，表明需要进一步优化治疗窗口。阶段特异性分析和作用速度表明，这两种活性物质（curcusones B和C）作为慢作用抑制剂，对晚期环状体和早期滋养体阶段具有优先效力。显微镜检查显示了形态学退化和寄生虫发育减少。 讨论： 这些发现突出了curcusones B和C作为疟疾药物开发管线中有前景的先导候选化合物的潜力。

研究背景与目的

疟疾仍然是全球特别是撒哈拉以南非洲面临的重大公共卫生挑战，2024年全球估计有2.82亿病例和61万人死亡。其中，恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）是导致该地区疾病负担的主要物种。尽管过去几十年间疟疾防控取得了一定进展，但抗疟药物的耐药性问题日益严峻，例如氯喹耐药性早在20世纪50年代末就已出现并广泛传播，而近期青蒿素的部分耐药性也在东南亚、南美和东非等地独立出现。由于以青蒿素为基础的联合疗法仍是治疗恶性疟原虫疟疾的基石，耐药性的持续演化和地理扩张凸显了发现具有新型化学骨架和作用机制的抗疟化合物的迫切需求。

天然产物在抗疟药物发现史上取得了显著成功，如源自金鸡纳树的奎宁和从中草药黄花蒿中提取的青蒿素。传统知识继续启发着现代研究，许多植物化学物如黄酮类、生物碱和萜类显示出显著的抗疟原虫活性。麻风树（Jatropha curcas L.）是一种多用途多年生植物，在非洲、亚洲和拉丁美洲的传统医学中被用于治疗多种感染和炎症性疾病，其叶片和根部的提取物已被报道具有抗疟原虫活性。尽管麻风树中的二萜类化合物已显示出包括抗寄生虫在内的多种生物活性，但其根部特有的jatropholane和rhamnofolane二萜类的抗疟原虫特性，特别是在红细胞内发育周期中的相对效力、时间药理学和潜在分子靶点方面，仍缺乏充分表征。因此，本研究旨在系统调查麻风树根部的抗疟原虫成分，重点研究rhamnofolane二萜类，明确最活跃化合物的效力、寄生虫阶段特异性和时间药理学特征。

主要技术方法

研究人员采用了以下关键技术方法：

1. 1.
   植物材料处理与化合物分离：麻风树根部采集于喀麦隆北部地区，经干燥研磨后用乙醇室温浸提获得粗提物。随后通过液-液分配得到正己烷、二氯甲烷、丙酮和正丁醇四个组分。对活性最强的二氯甲烷组分进行反复硅胶柱层析，分离得到12个已知化合物，其结构通过核磁共振波谱（NMR）和高分辨质谱（HR-MS）进行鉴定。
2. 2.
   体外抗疟原虫活性测试：使用SYBR Green I荧光法，针对氯喹敏感株（Pf3D7）和多药耐药株（PfDd2）评估提取物、组分和纯化化合物的抗疟原虫活性，计算半数抑制浓度（IC₅₀）。
3. 3.
   细胞毒性评估：通过基于刃天青的荧光检测法，评估活性化合物对非洲绿猴肾上皮细胞（Vero细胞）的细胞毒性，计算半数细胞毒性浓度（CC₅₀）和选择性指数（SI）。
4. 4.
   药效动力学分析：包括作用速度分析（将异步培养的寄生虫分别暴露于药物24、48和72小时，比较IC₅₀变化以判断快/慢作用）和阶段特异性分析（使用高度同步化的寄生虫，在早期环状体、晚期环状体、早期滋养体、晚期滋养体和裂殖体五个8小时窗口分别给药，通过流式细胞术结合SYBR Green和MitoTracker Deep Red FM双染定量各阶段的抑制效果）。

研究结果

3.1 麻风树的研究揭示了一类含有药效团的新化合物，具有抗疟应用潜力

研究人员从麻风树根部分离鉴定了12个已知化合物，包括二萜类（jatropholone A/B混合物、jatrophol/epi-jatrophol混合物、curcusone B和curcusone C）、三萜类（3-O-乙酰基齐墩果酸）、鞣花酸衍生物（3,3′,4-三-O-甲基鞣花酸）以及甾体类（stigmastane 3β,5α,6β-三醇、β-谷甾醇和豆甾醇混合物、β-谷甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷）。

3.2 分离化合物1–12的NMR数据

研究人员详细描述了这些化合物的¹H和¹³C NMR数据，为结构确证提供了关键证据。例如，二萜类化合物在氢谱中显示甲基特征信号（δ_H 0.68–1.01 ppm），碳谱中则观察到羰基、羟基和双键碳的特征化学位移。

3.3 药物筛选确定了有望增强疟疾药物发现管线的候选化合物

研究人员对所有提取物、组分和分离化合物进行了体外抗疟原虫活性评价。结果表明，二氯甲烷组分（JCRD）对两株寄生虫均表现出良好活性（IC₅₀分别为17.44和12.12 μg/mL）。在分离的化合物中，两种rhamnofolane衍生物——curcusone B和curcusone C展现出最强的抗疟原虫活性，其对Pf3D7和PfDd2株系的IC₅₀值均在亚微摩尔级别（0.63–1.24 μM）。此外，jatrophol/epi-jatrophol混合物也显示出中等活性（IC₅₀为5.06和29.96 μM）。值得注意的是，curcusones B和C对多药耐药株PfDd2同样有效，耐药指数（RI）较低。

3.4 对晚期环状体和早期滋养体的特异性抑制驱动了curcusones B和C的效力

阶段特异性分析结果显示，curcusone B对晚期环状体和早期滋养体阶段具有优先抑制活性，IC₅₀值低于1 μM，而对早期环状体的活性较弱（IC₅₀为9.75 μM）。curcusone C则对晚期环状体、早期滋养体和裂殖体均表现出强效抑制（IC₅₀分别为0.37、1.06和0.83 μM），但对早期环状体活性最低（IC₅₀ > 10 μM）。吉姆萨染色显微镜观察进一步证实，两种化合物处理后，寄生虫发育延迟、形态退化，最终导致培养物中主要为未感染的红细胞，表明其具有持久的抑制作用。

3.5 Curcusones B和C作为慢作用化学型，这解释了它们对恶性疟原虫后期发育阶段更强的效力

作用速度分析显示，curcusones B和C在24小时短时间暴露后活性很低（IC₅₀约8–10 μM），但在48小时和72小时暴露后活性显著增强（IC₅₀降至1–3 μM），呈现出典型的慢作用特征。这与快速作用的对照药物双氢青蒿素（DHA）在所有时间点均保持高效，以及慢作用对照药物阿托伐醌（atovaquone）在长时间暴露后效力剧增的模式一致。

讨论与结论

讨论部分总结： 本研究通过生物活性指导的分离策略，从麻风树中发现了具有强效抗疟原虫活性的curcusones B和C。这两种化合物对氯喹敏感株和多药耐药株均有效，表明其可能具有新颖的作用机制，不易受现有耐药机制影响。阶段特异性分析揭示了它们独特的药理特征：主要作用于寄生虫的无性血液阶段后期（晚期环状体至裂殖体），并且起效缓慢。这一特征不同于快速杀灭早期环状体的青蒿素类药物，暗示其可能靶向不同的生物学过程或通路。尽管两种化合物结构相似，但它们的阶段特异性活性模式略有差异（curcusone B更偏好晚期环状体和早期滋养体，而curcusone C对裂殖体也有强效），这可能与其细微的结构差异有关。研究也存在局限性：仅使用了两个实验室株系，未涵盖临床相关的青蒿素耐药株；细胞毒性评估有限，尚未全面评估对人源细胞的选择性；所有实验均为体外研究，缺乏药代动力学、代谢稳定性和体内疗效数据。

结论部分翻译： 总体而言，本研究表明，curcusones B和C是强效的抗疟原虫化合物，它们对Dd2实验室株系保持活性，优先影响后期的无性血液阶段，并表现出延迟起效的特性。这些经过实验验证的特征定义了一个连贯的药理表型，并将curcusone骨架确定为抗疟研究的有利起点。未来的工作应结合药物化学、直接靶点验证研究、更广泛的寄生虫测试、选择性分析以及体内药理学研究，以确定curcusones B和C是否有望进入抗疟先导化合物优化阶段。