《Frontiers in Microbiology》：cgMLST typing reproducibility is maintained across diverse whole-genome sequencing workflows in a multi-country HERA2 surveillance pilot
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引言： 全基因组测序（Whole-genome sequencing, WGS）已成为传染病监测中不可或缺的工具，然而其在各实验室间的实施仍存在异质性。作为HERA2项目的一部分，来自四个欧洲国家的六个实验室于2023年参与了一项试点环形试验，使用一套标准化的
引言： 全基因组测序（Whole-genome sequencing, WGS）已成为传染病监测中不可或缺的工具，然而其在各实验室间的实施仍存在异质性。作为HERA2项目的一部分，来自四个欧洲国家的六个实验室于2023年参与了一项试点环形试验，使用一套标准化的25株细菌分离株（代表五种公共卫生相关菌种）进行检测。本研究旨在评估实验室特异性WGS工作流程的可比性和重现性，并确定与工作流程相关的变异性是否会影响适用于常规监测和暴发调查的基于cgMLST的解释。
方法： 参与实验室应用其既定的湿实验室工作流程，包括不同的样本处理、DNA提取和文库制备方法及测序平台。所有实验室均进行了Illumina测序，其中两个实验室还具备牛津纳米孔技术（Oxford Nanopore Technologies, ONT）测序能力。为专门评估由湿实验室程序引入的变异性，所有原始测序数据均使用相同的生物信息学流程进行集中处理。重现性主要通过相对于实验室1 Illumina比较组装的cgMLST等位基因距离以及聚类分配的一致性进行评估，并结合测序和组装变异性的分析。
结果： 尽管湿实验室工作流程和技术测序特征存在显著差异，但符合质量要求的Illumina记录在各实验室间仅显示出微小的cgMLST等位基因差异（0-2个等位基因）以及一致的聚类分配。测序和组装指标因实验室、菌种和技术因素而异，但这种变异性并未妨碍符合预设最低质量要求的记录获得一致的基于Illumina的聚类解释。ONT结果更依赖于菌种，若干记录（特别是针对肠道沙门氏菌 Salmonella enterica 的记录）未能达到所需的cgMLST靶标完整性。这些ONT发现应结合2023年环形试验时可用的技术水平进行解读。
结论： 研究结果表明，为实现跨实验室可比的基于Illumina的cgMLST结果，可能不需要完全标准化湿实验室工作流程。相反，只要产生的测序数据符合适当的最低质量要求，实验室可以保留经过验证的本地工作流程。这支持了一种务实的多实验室基因组监测方法，该方法优先考虑数据质量和适用性，而非统一各个湿实验室的操作规程。
研究背景与问题
全基因组测序（Whole-genome sequencing, WGS）已成为传染病监测和暴发调查的关键工具，能够早期发现流行病学信号不明显的疫情。尽管其在欧盟/欧洲经济区（EU/EEA）的应用自2010年代中期以来迅速扩展，但大规模整合仍面临高成本、基础设施有限及人员短缺等挑战。此外，不同实验室间湿实验和干实验方案的缺乏标准化可能导致序列数据质量的差异，这种异质性是否会损害用于暴发检测的分型结果的可比性尚需系统评估。为应对这些挑战，欧盟委员会在卫生应急准备与响应局（HERA）框架下启动了能力建设行动。作为HERA第二轮行动的一部分，HERA2项目联盟（包括奥地利、克罗地亚、希腊和匈牙利）开展了一项试点环形试验。该研究的核心目的是评估不同国家实验室各自惯用的WGS工作流程（从样本处理到测序）所产生数据的可比性和重现性，并探究工作流程相关的变异性是否会影响基于核心基因组多位点序列分型（core genome Multi-Locus Sequence Typing, cgMLST）的流行病学解释，从而为建立务实、有效的多实验室联合基因组监测体系提供科学依据。
研究方法与技术路线
研究人员设计并实施了一项跨四国六实验室的环形试验。关键技术方法如下：
- 1.
标准化样本面板：由组织方实验室（Lab 1，奥地利）分发一套包含25株细菌分离株的标准化面板，涵盖五种公共卫生重要病原体：空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）、沙门氏菌属（Salmonella spp.）、单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）和粪肠球菌（Enterococcus faecium）。
- 2.
异质性湿实验室工作流程：各参与实验室（Lab 1至Lab 6）被要求使用其自身既定的常规湿实验室流程进行处理，包括样本培养、DNA提取（手动或自动）、文库制备（如Nextera XT、Illumina DNA Prep）和测序。所有实验室均采用Illumina平台进行短读长测序，其中Lab 1和Lab 6额外使用牛津纳米孔技术（ONT）进行长读长测序。
- 3.
中心化生物信息学分析：为排除生物信息学流程差异带来的干扰，所有实验室产生的原始测序数据（FASTQ文件）均由组织方实验室（Lab 1）使用统一的生物信息学流程进行集中处理和分析。该流程包括使用MBioSEQ Ridom Typer v9.0.3进行质量控制、修剪和SPAdes v3.11.1从头组装，随后利用已验证的cgMLST方案进行分型和聚类分析。
- 4.
严格的数据过滤与统计分析：研究设定了最低纳入标准（覆盖度≥30×，cgMLST良好靶标百分比≥95%）以确保数据质量。在此基础上，进一步应用了多种过滤策略（如基于Q30/重叠群数量的过滤、主成分分析（PCA）多元异常值过滤）。统计分析方法包括单变量Kruskal-Wallis检验、多变量PERMANOVA、混合效应方差组分分解、组内相关系数（ICC）计算以及Bland-Altman一致性分析，以全面评估实验室间差异及其对分型结果的影响。
研究结果
3.1 测序特征与实验室表现
总体分离株回收率较高，但存在个别失败案例，尤其在空肠弯曲杆菌（C. jejuni）和部分实验室中。各实验室在样本储存方式、DNA提取模式（手动/自动）、提取试剂盒、文库制备方法和测序平台等方面存在显著异质性。在预期的200条测序记录中，最终有162条记录满足最低质量标准并被纳入后续分析。
3.2 测序与组装质量指标的單变量分析结果
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Q30碱基百分比：在所有五个菌种中，Q30均显示出高度显著的实验室相关差异，表明测序质量指标对技术实现细节（尤其是实验室与测序仪的组合）非常敏感。
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重叠群数量：实验室效应呈现物种依赖性。肠道沙门氏菌（S. enterica）表现出统计学显著的实验室效应，而其他菌种则未观察到显著差异。
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N50：各实验室间的N50值差异不显著，但菌种间的差异远大于同菌种内的实验室间变异。
3.3 多变量分析解读
主成分分析（PCA）显示，菌种和测序技术（Illumina vs. ONT）是驱动测序和组装指标变异的主要结构因素。单因素PERMANOVA证实菌种与多变量指标显著关联，其边际R2值在所有过滤策略下均为最大（约25%-42%），远超实验室、文库制备方法等技术因素，后者贡献较小（R2通常低于13%）。
3.4 分型结果与跨实验室重现性
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在符合质量要求的记录中，Illumina数据产生的cgMLST等位基因距离相对于Lab 1的比较器组装非常小（0-2个等位基因），且所有实验室对同一生物学分离株的聚类分配结果完全一致。
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ONT数据的结果更具物种依赖性，部分记录（尤其S. enterica）未能达到cgMLST靶标完整性阈值而被排除。对于保留的ONT记录，等位基因距离范围较大（如单核细胞增生李斯特菌L. monocytogenes为0-8个等位基因）。
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Bland-Altman分析显示，各Illumina实验室间的平均等位基因距离差异极小（-0.24至0.15个等位基因），一致性界限较窄。ONT实验室间的差异更大，一致性界限更宽。
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混合效应模型方差组分分解显示，在Illumina子集中，实验室解释了Q30变异的大部分（71.3%），而菌种解释了N50和cgMLST良好靶标恢复变异的主要部分（分别占60.3%和62.6%）。
3.5 混合效应模型
方差组分分解进一步确认，不同测序和组装指标受不同生物学和技术因素的影响。例如，在合并数据集中，测序技术主导了Q30（59.7%）和N50（47.4%）的变异，而菌种几乎解释了组装大小的全部变异（99.3%）。在Illumina子集中，实验室对Q30变异贡献最大，而菌种对N50和cgMLST靶标恢复贡献最大。
讨论与结论
讨论总结：本环形试验的核心发现是，尽管各实验室的湿实验室工作流程存在显著差异，但只要测序数据满足预设的最低质量标准，基于Illumina平台的cgMLST分型结果便展现出高度的可比性和重现性。这表明，在多实验室基因组监测网络中，强制统一湿实验室流程并非必要，更重要的是确保产出数据适合进行可靠的分型分析。这一发现支持一种更为务实的方法：允许实验室保留其经过验证的本地工作流程，同时将重点放在数据质量控制上。研究同时指出，ONT数据在本次试验（反映2023年技术水平）中的表现不如Illumina稳定，尤其对于基因组复杂的菌种（如S. enterica），其cgMLST靶标恢复率和等位基因准确性有待提高，这与当时ONT技术的固有错误率有关。研究也承认了其局限性，包括ONT样本量小、每菌种仅5株分离株导致的遗传多样性有限、湿实验室因素间的混杂以及未评估不同生物信息学流程的影响等。
研究结论翻译：本试点环形试验表明，只要测序数据符合适当的最低质量要求，可能无需统一湿实验室工作流程即可获得可比的基于Illumina的cgMLST聚类解释。技术性的测序和组装指标在不同实验室间存在差异，但这些差异并未阻止一致的聚类分配。因此，对于多实验室监测而言，确保基因组数据适用于可靠分型，可能比要求每个实验室使用相同的湿实验室工作流程更为重要。在本2023年的数据集中，ONT结果更具物种依赖性，鉴于其较小的ONT子集和当时的技术水平，应谨慎解读。
