《Frontiers in Insect Science》：Survey of viruses associated with the whitefly Bemisia tabaci in cucurbits in Georgia, United States
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烟粉虱（Bemisia tabaci）是重要的农业害虫，通过传播植物病毒每年对蔬菜生产造成超过1亿美元的损失。表征B. tabaci的病毒组（virome）对于理解其传毒潜力（vectoring potential）以及识别候选病毒生物防治因子至关重要。本研究
烟粉虱（Bemisia tabaci）是重要的农业害虫，通过传播植物病毒每年对蔬菜生产造成超过1亿美元的损失。表征B. tabaci的病毒组（virome）对于理解其传毒潜力（vectoring potential）以及识别候选病毒生物防治因子至关重要。本研究于2023年和2024年连续两年从美国佐治亚州蒂夫顿（Tifton）的葫芦科作物上采集B. tabaci。提取总RNA并进行核糖体RNA去除（ribodepletion），随后在Illumina NovaSeq 6000平台上进行150 bp双端测序（paired-end sequencing）。生物信息学分析包括对原始reads进行质量评估和修剪，随后在Alabama HPC平台上比对到B. tabaci参考基因组（GCF_918797505.1），再通过Galaxy平台比对到病毒数据库（viral2019-03）。利用rnaviralSPAdes进行从头转录组组装后，通过基于BLAST的搜索，将组装的contigs与NCBI非冗余核苷酸（nt）和非冗余蛋白质（nr）数据库进行比对，筛选具有病毒相似性的序列。通过reads比对、覆盖度评估、分类学分配（taxonomic assignment）和开放阅读框（open reading frame, ORF）预测对候选病毒contigs进行评估。该分析鉴定出代表植物病毒、噬菌体（bacteriophage）和昆虫相关病毒的contigs。从两个年份的样本中均组装出近完整的黄瓜褪绿黄化病毒（cucurbit chlorotic yellows virus, CCYV）RNA1和RNA2序列，其中2024年样本中的丰度更高。研究人员还检测到一个与蟋蟀麻痹病毒属（Cripavirus）相关的dicistrovirus样序列，该序列在两个年份中均存在，并包含两个主要开放阅读框。CCYV和该dicistrovirus样序列是仅有的在两个采样年份中均具有足够reads支持进行基因组组装和分子验证的病毒靶标。
烟粉虱（Bemisia tabaci）是全球最重要的农业害虫之一，其通过传播多种植物病毒每年造成超过1亿美元的蔬菜生产损失。该害虫寄主范围极广，可在作物与非作物寄主间转移，从而在作物种植间歇期维持病毒种群。美国佐治亚州气候温和、农业景观多样，烟粉虱可全年活动。2017年该州爆发的烟粉虱-病毒复合体疫情造成棉花和蔬菜作物超过2亿美元的经济损失。在葫芦科作物系统中，由烟粉虱传播的毛色病毒属（Crinivirus）病毒，特别是黄瓜褪绿黄化病毒（CCYV），已成为持续性的经济威胁。然而，高通量测序检测到的病毒信号并不等同于真实的媒介-病毒稳定关联，区分持续性关联与瞬时获得信号是该领域的关键挑战。
为应对这一挑战，研究人员于2023年和2024年连续两年从佐治亚州蒂夫顿（Tifton）的葫芦科作物田采集烟粉虱样本，利用RNA测序（RNA-seq）表征其病毒组（virome）。通过reads分类、基因组组装、reads比对、系统发育分析和分子验证等多维度方法，研究旨在识别在两个采样年份中均稳定出现的病毒靶标。结果显示，CCYV和一种与蟋蟀麻痹病毒属（Cripavirus）相关的dicistrovirus样序列是仅有的两个在两年中均得到充分支持的病毒靶标，其中CCYV的丰度在2024年更高。
研究人员采用的主要关键技术方法包括：（1）基于Illumina NovaSeq 6000平台的RNA测序，对核糖体RNA去除后的总RNA进行150 bp双端测序；（2）运用FastQC和BBDuk进行reads质量控制与修剪，利用Bowtie2将reads比对到烟粉虱参考基因组（GCF_918797505.1）以去除宿主序列；（3）通过Galaxy平台上的Kraken2和Bracken进行病毒分类与丰度估计，使用rnaviralSPAdes进行从头组装；（4）通过BLASTn/BLASTx搜索对组装的contigs进行交叉验证，并评估reads比对覆盖度；（5）基于细胞色素氧化酶I（COI）参考数据库确认烟粉虱物种身份；（6）利用IQ-TREE进行最大似然系统发育分析；（7）通过RT-PCR对主要病毒靶标进行分子验证。样本采集自佐治亚州蒂夫顿的葫芦科作物田，2023年和2024年各采集一批，每批选取100只粉虱进行RNA提取。
研究结果如下：
测序：两个年份分别产生约132百万和135百万条reads，碱基质量高，GC含量分布正常，符合下游分析要求。
生物信息学与交叉验证：Kraken2在两个年份中均鉴定出多种植物病毒、昆虫病毒和噬菌体相关序列。2023年样本中检出CCYV、蚜虫致死麻痹病毒（ALPV）、番茄斑萎病毒（TSWV）、辣椒褪绿斑驳病毒（PCSV）等；2024年样本中检出CCYV、ALPV、大苏河病毒（BSRV）、棉花卷叶矮缩病毒（CLRDV）等。然而，Bracken相对丰度估计显示，CCYV和ALPV/dicistrovirus相关分配占病毒reads的绝大多数。Kraken2分类reads数从2023年的265条（0.0017%）增至2024年的3065条（0.022%）。Reads比对结果显示，dicistrovirus相关reads在两年中均覆盖ALPV参考基因组的大部分区域，但BLASTn的最佳匹配为Culex dicistrovirus 1；CCYV RNA1覆盖率从2023年的59%升至2024年的99%。其他病毒分类群缺乏有效reads支持。
基于序列分析的物种鉴定确认：COI序列分析显示，MEAM1是两个采样年份中的优势隐种。2023年样本中存在一些非MEAM1的短contigs匹配，但这些信号在2024年较弱，整体支持MEAM1主导的样本组成。
系统发育分析：最大似然系统发育分析将dicistrovirus样序列与Culex dicistrovirus 1和ALPV置于同一进化枝中，且与Culex dicistrovirus 1最接近。该序列的ORF1和ORF2氨基酸一致性分别为95%和91-92%。CCYV RNA1和RNA2的系统发育分析显示，本研究恢复的序列与已报道的美国分离株（包括佐治亚州分离株）聚类，不构成新的独特株系。
病毒序列验证：RT-PCR检测在2023年和2024年样本中均扩增出了预期大小的dicistrovirus片段（995 bp）和CCYV RNA1片段（953 bp），证实了这两个病毒靶标在两年中的持续存在。
讨论与结论：本研究表明，尽管烟粉虱样本中可检出多种低丰度病毒信号，但仅有CCYV和dicistrovirus样序列在两年中均满足reads分配、组装、比对和分子验证的全部标准。CCYV是一种由烟粉虱传播的植物病毒，其序列与佐治亚州已知分离株高度相似，表明该病毒在该产区的持续存在。Dicistrovirus样序列与昆虫相关双顺反子病毒（dicistrovirus）密切相关，但其是否感染烟粉虱或仅为植物相关或取食获得仍需实验验证。COI证据不支持MED隐种在两个年份间丰度增加，而CCYV检出率与隐种组成无关。低丰度病毒信号可能是植物来源、共生菌相关或取食残留RNA，应谨慎解读。总体而言，这项研究为美国东南部田间烟粉虱相关病毒提供了序列水平证据，识别出两个最值得进一步生物学验证的病毒靶标，为理解烟粉虱-病毒互作和病害管理奠定了基础。
