《Plant Biotechnology Journal》：Lessons From CABBI: Advancing Vegetative Oil Production in C4 Crops Through a Vertically Integrated DBTL Framework
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全球对可再生液体燃料和生物基化学品的需求日益增长，促使人们将目光聚焦于通过工程化手段使高生物量C4禾本科植物在其营养组织中积累三酰甘油（triacylglycerol, TAG）。实现这一目标需要分子生物学、作物科学、化学工程和生命周期评估等领域的协同解决方案
全球对可再生液体燃料和生物基化学品的需求日益增长，促使人们将目光聚焦于通过工程化手段使高生物量C4禾本科植物在其营养组织中积累三酰甘油（triacylglycerol, TAG）。实现这一目标需要分子生物学、作物科学、化学工程和生命周期评估等领域的协同解决方案，而这些学科通常难以在一个研究项目中独立运作。先进生物能源与生物产品创新中心（Center for Advanced Bioenergy and Bioproducts Innovation, CABBI）正是为了提供这种整合而成立的，该中心针对三种C4原料作物——甘蔗属杂交种（saccharum）、高粱（sorghum）和芒草（miscanthus），实施了设计—构建—测试—学习（Design–Build–Test–Learn, DBTL）框架。通过迭代的DBTL循环，CABBI已培育出营养组织TAG水平显著提高的转基因甘蔗和高粱品系，多点田间试验证实了该性状的稳定遗传性和脂质产量。研究人员还利用该整合体系开发了一种双系统生物炼制工艺，能够同时回收营养体脂质和可发酵糖，其糖浓度足以达到工业乙醇滴度。重要的是，这种完全整合的跨学科数据集成模型揭示了目前阻碍富含TAG的营养体油脂实现商业可行性的关键制约因素，包括：（i）活跃的脂质周转，（ii）光合作用权衡，（iii）空间异位表达，以及（iv）生物加工挑战。CABBI正利用新兴技术，包括生物铸造厂支持的构建体筛选、精准基因组编辑和机器学习辅助的调控元件设计，进一步加速DBTL循环。更广泛地看，本工作阐明了如何通过整合多领域专业知识的中心规模研究加速发现与转化，从而将这些系统推向更广阔的农业市场，并为构建更具安全性和韧性的生物经济作出贡献。
1 引言：集成创新的必要性
CABBI是美国能源部下属的生物能源研究中心，其核心目标之一是改造作物使其在营养组织中产油。这种以三酰甘油为主要形式的营养体油脂含有多种常见及独特的脂肪酸种类，适用于平台化学品、生物材料、生物制品和生物燃料。由于锂离子电池的能量密度仅为柴油的约2%，无法满足长途运输需求，而液体生物燃料能量密度可达石化燃料的约90%，因此发展生物燃料对于海运、航空和重型陆路交通尤为重要。传统油料作物的种子产油量受限于碳向生殖结构的分配，而通过在C4高生物量禾草中积累营养体TAG，理论上可实现比油料作物高一个数量级的产油量，并支持“双流”生物炼制模式，即同时提取TAG用于液体燃料和平台化学品，并将剩余木质纤维素残渣转化为乙醇。
2 设计：面向使命导向型生物经济的战略架构
CABBI在设计阶段从多个尺度同步推进，确保原料和代谢工程设计始终与生物质解构、规模化回收和转化兼容。
2.1 原料设计：选择高生物量C4平台。为避免与粮食生产竞争土地，CABBI选择了三种互补的高生物量C4作物：芒草、高粱和甘蔗属杂交种。这些作物通过C4光合途径实现高生物量，具备优异的水分和氮素利用效率，年干物质产量可达20–70 Mg/ha，且适宜在美国雨养边际土地上种植。此外，它们还能带来土壤固碳、减少侵蚀和养分淋失等生态效益。
2.2 代谢设计：实施3P蓝图。CABBI采用“推动、拉动和保护”（Push, Pull, Protect, 3P）策略来设计营养体油脂积累。其中，“Push”因子利用转录因子WRINKLED1激活中心代谢和脂肪酸合成基因；“Pull”因子通过二酰甘油酰基转移酶催化TAG组装的最后一步限速反应；“Protect”因子则通过油体蛋白包被脂滴以阻止脂肪酶接触，或抑制TAG分解的关键酶如SDP1和TGD1，从而保护已合成的TAG不被降解。
2.3 生物加工设计：规划生物质解构。CABBI并行开发产油原料和工业加工流程，目标是释放可发酵糖的同时保持脂质完整性。研究表明，水热预处理是无化学催化剂的最佳方法，能有效保护油脂并便于后续回收。此外，在榨汁前去除叶片是优选方案，可防止脂质吸附和糖浓度稀释。
3 构建：开发高产营养体TAG生物量作物的遗传架构
构建阶段旨在培育超越常规育种水平的营养体TAG积累作物，这需要完善基因组资源、转化技术和外源DNA递送方法。
3.1 高粱：概念验证的一年生二倍体作物。作为一年生二倍体作物，高粱具有丰富的遗传和基因组资源，适合进行快速的概念验证。CABBI利用农杆菌介导的转化和叶材料转化法，结合Foxtail Mosaic病毒递送形态发生调节因子，大幅提高了转化效率和品种适用范围，并成功获得了首个无转基因的CRISPR编辑高粱。
3.2 甘蔗属：工程化复杂多倍体。针对能量甘蔗等高度难转化的多倍体物种，CABBI优化了基因型选择、培养基和基因递送方法。基因枪法因其能共递送多个非连锁基因构建体而被优先采用。CABBI实现了甘蔗中首次靶向诱变和精确基因编辑，并开发了CRISPR干扰技术以实现高达82%的基因抑制，进而开展了首个CRISPR编辑甘蔗的田间试验。
3.3 芒草：突破转化瓶颈。芒草为古异源多倍体，功能冗余度高，实现真正敲除表型需同时靶向所有同源基因和等位基因。CABBI完成了芒草基因组测序，建立了基于基因枪法的转化和基因组编辑流程，并通过靶向高度保守的LEMON WHITE 1基因，成功在三个芒草物种中获得了编辑植株。
4 测试：验证转基因设计的产油性能与系统表现
测试阶段是连接实验室遗传构建与工业化可行性的关键桥梁。
4.1 甘蔗平台：从甘蔗到能量甘蔗。早期油甘蔗品系在叶片和茎秆中分别积累了最高达1.9%和0.9%干重的TAG。通过进一步抑制SDP1、PXA1或TGD1，叶片TAG含量提升至5.5%干重。田间试验证实转基因稳定遗传，脂质产量比温室条件下高出2倍。随后，研究重点转向能量甘蔗，通过在内含子优化的DGAT1构建体中引入内含子，使TAG积累量在田间复测中达到叶片7.6%干重、茎秆1.3%干重。然而，高TAG积累常伴随高达52%的生物量损失，但低TAG积累品系未表现出生物量差异。目前，田间能量甘蔗的脂质回收量约为0.38 MT/ha，接近大豆的0.44 MT/ha，但仍低于CABBI设定的1.0 MT/ha目标。
4.2 高粱平台：高价值油脂与可持续航空燃料。高粱平台侧重于生产中链脂肪酸等具有定制化学性质的高附加值油脂。初始转基因品系在温室中叶片和茎秆TAG分别达2.5%和2.0%干重，但主要积累常见的C16和C18脂肪酸。田间试验表明，最优品系叶片和茎秆TAG分别可达5.5%和3.5%干重，较野生型提高78倍和58倍，多地点平均脂质产量约为0.3 MT/ha。重要的是，多站点田间评估未发现生物量显著降低，但部分品系存在约18%的生物量减少，且该影响具有基因型依赖性。
4.3 原料生物加工：从实验室到田间再到生物精炼厂。CABBI开发的水热预处理无需外加酸碱催化剂，能限制糖分解产物形成，提高糖释放和乙醇产量，并实现更高的总脂肪酸回收率。经水热预处理的能量甘蔗、油甘蔗、高粱和芒草，以尿素为廉价氮源时，乙醇产量可达250–290 mL/kg生物量。此外，通过集成双级过滤器实现蜡质回收，并采用机械盘磨提高酶解效率。在分批补料酶解条件下，糖浓度可达200–250 g/L，足以实现超过40 g/L的工业乙醇滴度。脂质回收方面，经发酵后蒸馏和离心分离，最佳品系的脂质回收率可达88.7%，对应脂质产量为0.38 MT/ha。
5 学习：通过集成反馈优化植物生物设计与生物加工
学习阶段整合实验数据、生理观测和系统层面分析，揭示下一代设计的方向。
5.1 克服代谢反馈调控。研究发现，WRI1过表达虽能上调脂肪酸合成基因，但也导致淀粉与TAG之间的无效循环，并伴随单酰甘油脂肪酶基因上调超过60倍。这表明代谢失衡和无效循环严重限制了TAG积累。通过突变WRI1的泛素化位点可稳定该蛋白并增加TAG积累，类似的调控域也在DGAT和油体蛋白中被发现。
5.2 识别生物量下降的生物学原因。油甘蔗和能量甘蔗中高达52%的生物量减少不能简单归因于TAG积累量本身。可能的原因包括：TAG合成争夺了叶绿体脂质前体，导致光合膜组成改变（如18:3脂肪酸减少）；在保卫细胞等特化细胞中阻止TAG分解可能影响气孔运动；以及游离脂肪酸积累引发的细胞毒性。但这些假设仍需进一步验证。
5.3 优化生物加工效率。研究发现纤维压榨后的残糖在水热预处理中会转化为发酵抑制剂。CABBI开发了半集成式生物工艺，将18小时酶解与发酵在同一反应器中完成，在25%–30%高固含量下实现葡萄糖和木糖的完全利用，乙醇产量达250–290 L/吨生物量，同时大幅减少了NaOH和尿素的投入。
6 新兴技术：加速设计—构建—测试—学习循环
CABBI正在整合计算工具和先进工程手段以缩短从实验室发现到田间验证的周期。
6.1 预测建模与生物铸造厂筛选。CABBI依托伊利诺伊大学的两座生物铸造厂，结合自动化克隆平台iBioFAB和FAST-PB自动化植物工程系统，实现对构建体设计的高通量筛选。结合蛋白质工程工具ESM2，研究人员在4周内完成了约1000个变体的四轮筛选。
6.2 提高转化效率。三元载体系统和胸腺嘧啶营养缺陷型农杆菌菌株的开发可将高粱转化效率提高29%–164%。新型基因枪导流枪管可将基因传递效率提高10倍以上。碱基编辑器和先导编辑器已在多倍体作物中展现出应用前景，而DNA-free编辑技术也为监管优势提供了可能。
6.3 先进的调控系统。为减轻组成型启动子带来的脱靶效应，CABBI探索了诱导型启动子和组织特异性启动子。通过单细胞转录组学图谱，研究团队鉴定了高粱茎秆特异性基因及其启动子。合成启动子技术通过组合顺式调控元件实现空间限定性表达，结合机器学习和单细胞组学，有望实现正交、多重化的精确调控。
7 结论：C4生物经济的未来
CABBI通过DBTL循环证明，能量甘蔗和油高粱的脂质生产力已接近传统大豆水平。关键发现包括：营养组织会通过增强TAG分解来主动对抗脂质积累；生物量下降可能源于空间异位表达、光合破坏或膜相关权衡而非简单的碳限制；脂质可回收性和抑制剂形成必须在生物设计阶段加以考虑。未来方向包括稳定关键生物合成蛋白、克服反馈调控、抑制脂质分解以及将转基因表达限制在不损害生物量的细胞类型或发育阶段。
