空气污染物与抑郁症关联的候选分子枢纽NOS2：一项整合计算与实验研究

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：NOS2 as a candidate molecular link between air pollutants and depression: an integrated computational and experimental study

　　

中文翻译（摘要） 引言： 探索空气污染暴露与抑郁症之间关联的分子及潜在机制的研究仍然匮乏。本研究旨在阐明空气污染物与抑郁症之间可能相关的调控分子及潜在机制，从而为疾病预防和治疗提供科学线索。 方法： 纳入七种空气污染物（SO2、NO、苯、CO、O3、NO2和甲苯）。采用多层次研究框架。利用网络毒理学和基因表达汇编（GEO）数据库识别空气污染物的潜在靶点及通路；利用交集基因构建机器学习诊断模型，并选择最优模型进行验证。应用孟德尔随机化（MR）评估抑郁症与相关基因之间的遗传因果关联。进行单细胞虚拟扰动分析以解析潜在分子机制。采用分子对接和分子动力学模拟评估特定污染物与抑郁症相关基因之间的结合亲和力及复合物稳定性。最后，开展体外细胞实验对计算发现进行初步验证。 结果： 通过将空气污染相关靶点与GEO抑郁症数据集取交集，鉴定出九个候选靶基因。集成机器学习分析提示一氧化氮合酶2（NOS2）在抑郁症中呈现表达差异。孟德尔随机化分析提示NOS2表达升高可能与抑郁症相关，支持两者之间存在可能的遗传因果关联。单细胞虚拟扰动提示在小胶质细胞中扰动NOS2可能影响炎症及氧化应激相关通路。分子对接预测七种污染物均可能结合NOS2，但预测结合能各异，其中苯和甲苯显示出相对较高的结合亲和力。分子动力学模拟进一步评估了苯–与甲苯–NOS2复合物的稳定性，提示甲苯与NOS2的结合更为稳定。体外细胞实验初步提示甲苯暴露可诱导BV2细胞发生炎症和氧化应激，NOS2表达变化可能参与该过程。然而，这些结果尚不能证明NOS2是抑郁症的因果中介因子，仍需进一步的功能实验加以验证。 讨论： 整合计算预测、遗传关联、网络扰动及细胞验证，NOS2可能是连接空气污染暴露与抑郁症的候选分子节点，其潜在机制可能涉及神经炎症和氧化应激。本研究为空气污染物与抑郁症之间可能的分子机制提供了新的假说和理论线索，但潜在机制仍需进一步的实验研究加以探索。

论文解读

一、研究背景与问题

空气污染已被国际癌症研究机构列为第一类致癌物。2019年全球疾病负担研究显示，空气污染是全球第四大死亡风险因素，与男性约292万例和女性约375万例死亡相关。一项涵盖12项研究、共61,217名参与者的荟萃分析表明，室内空气污染暴露与抑郁症显著相关（风险比RR=1.22，95%置信区间：1.13–1.31）。抑郁症作为一种高度流行的精神障碍，全球平均患病率约为10%且逐年上升，其病理机制尚不明确，主要表现为显著而持续的抑郁情绪、兴趣丧失和精神运动迟滞，常伴随进食或睡眠障碍等共病。近年来虽有研究评估空气污染暴露与抑郁症之间的相关性，但两者之间的潜在分子机制尚未得到充分表征。既往研究提示炎症和氧化应激可能参与其中，但具体的分子及生物学过程尚未被鉴定和描述。一氧化氮（NO）由一氧化氮合酶（NOS）催化精氨酸生成，其中NOS2为诱导型亚型，被认为是炎症性疾病的易感基因。神经炎症通路与抑郁症的发生、治疗反应及缓解相关，而氧化应激是抑郁症患者炎症系统功能障碍的主要驱动因素，由NOS2驱动的过量NO产生所导致。然而，空气污染物、NOS2与抑郁症之间的关联仍属未知。因此，开展本研究以阐明连接空气污染暴露与抑郁症的潜在调控分子及机制，为疾病预防和治疗提供科学依据。

二、研究内容与结论

研究人员整合网络毒理学、机器学习、分子对接、分子动力学模拟、孟德尔随机化（MR）和单细胞虚拟扰动等多种计算方法，并结合体外细胞实验，系统评估了七种常见空气污染物（苯、SO₂、NO、CO、NO₂、甲苯和O₃）与抑郁症之间的潜在关联。通过将空气污染相关靶点与GEO抑郁症转录组数据取交集，鉴定出九个候选靶基因；利用集成机器学习构建诊断模型并筛选关键基因；通过MR分析评估NOS2表达与抑郁症的遗传因果关联；通过单细胞虚拟扰动解析潜在分子机制；通过分子对接和分子动力学模拟评估污染物与NOS2的结合特性；最后通过体外细胞实验进行初步验证。研究结果表明，NOS2可能是连接空气污染暴露与抑郁症的候选分子枢纽，其潜在机制可能涉及神经炎症和氧化应激。这一发现深化了对空气污染健康效应的理解，为污染防控和抑郁症防治提供了科学依据。

三、主要关键技术方法

研究人员首先利用Target Net、Swiss Target Prediction和SEA三个数据库预测七种空气污染物的人类靶基因，共获得176个潜在靶基因。抑郁症相关转录组数据来源于GEO数据库的GSE32280和GSE76826两个数据集（共69个样本，含20例健康对照和49例非对照样本），经批次校正后进行加权基因共表达网络分析（WGCNA），获得760个抑郁症相关基因。取交集获得九个候选基因后，采用111种预设的单方法与两阶段机器学习流程构建诊断模型，以受试者工作特征曲线下面积（AUC）评估模型性能，并利用GSE44593和GSE53987两个独立数据集进行外部验证。孟德尔随机化分析采用eQTLGen联盟全血eQTL数据作为暴露工具变量，抑郁症汇总统计数据来自IEU OpenGWAS数据库（ID: ebi-a-GCST90038650，含27,568例病例和457,030例对照）。单细胞虚拟扰动基于GSE201687数据集（背外侧前额叶皮层单核RNA测序数据，含7例抑郁样组和7例健康对照组样本），使用scTenifoldKnk工具进行。分子对接采用CB-Dock服务器（基于AutoDock Vina 1.1.2），分子动力学模拟使用Gromacs 2024.4软件（Amber14sb蛋白力场、Gaff2配体力场、TIP4P水模型，100 ns模拟）。体外实验使用BV2小鼠小胶质细胞系（购自中国科学院细胞库，SCSP-5208）。

四、研究结果

空气污染物相关基因的获取： 通过三个数据库共鉴定出176个与七种空气污染物相关的潜在靶基因。

疾病相关基因的获取： 将GSE32280和GSE76826两个数据集合并并消除批次效应后，进行WGCNA分析，鉴定出11个共表达模块，其中绿松石色模块与抑郁症显著相关，共包含760个基因。

空气污染物与疾病相关基因的鉴定及富集分析： 将176个空气污染靶基因与760个抑郁症靶基因取交集，获得九个共同基因：NOS2、HRH4、PNMT、GRM2、PTGES、ABCG2、CA3、F2和CA7。GO功能富集分析显示主要富集于羧酸转运、有机酸转运、质膜外表面、核膜腔、碳酸脱水酶活性和水解酶活性等生物学功能。KEGG通路富集分析显示主要富集于神经活性配体–受体相互作用和氮代谢通路。

基于空气污染物水平的抑郁症筛查机器学习模型构建： 综合评估多种机器学习算法后，glmBoost+Ridge模型表现最优，平均AUC为0.692。经该模型筛选后，CA7（AUC=0.621）、F2（AUC=0.582）、GRM2（AUC=0.647）、NOS2（AUC=0.659）和PTGES（AUC=0.503）被选出进行进一步分析，其中NOS2的AUC值最高。差异表达分析显示NOS2在抑郁症中显著上调，提示NOS2可能在空气污染与抑郁症之间发挥关键的桥接调控作用。

孟德尔随机化分析： 集成MR分析显示NOS2表达与抑郁症风险相关（逆方差加权法：比值比OR=1.004，95%置信区间：1.000–1.008，P=0.043）。敏感性分析（包括留一法、异质性和水平多效性评估）表明结果稳健，不受单一SNP异质性或水平多效性的影响。

单细胞虚拟扰动结果： 对GSE201687数据集进行质量控制后，鉴定出43个细胞亚群，注释为九种主要细胞类型：星形胶质细胞、内皮细胞、室管膜细胞、成纤维细胞、γ-氨基丁酸能神经元、小胶质细胞、神经元、少突胶质细胞和少突胶质前体细胞。NOS2表达富集于小胶质细胞。对NOS2进行虚拟扰动后，差异调控基因显著富集于氧化应激反应、炎症反应、细胞对有毒物质的反应等生物学过程，以及PI3K-Akt、MAPK、氧化磷酸化、mTOR、坏死性凋亡、TNF、NF-κB和IL-17等信号通路。

分子对接结果： 七种空气污染物与NOS2的分子对接结合能分别为：苯?5.4 kcal/mol、SO₂?2.5 kcal/mol、NO?2.9 kcal/mol、CO?1.9 kcal/mol、NO₂?3.5 kcal/mol、甲苯?5.7 kcal/mol、O₃?3.5 kcal/mol。苯和甲苯与NOS2表现出较优的结合，其中甲苯结合能最低。

分子动力学模拟结果： 100 ns模拟显示，苯和甲苯的结合均未破坏NOS2的整体结构，蛋白保持紧凑稳定构象。自由能分布图显示NOS2–甲苯复合物形成单一集中的低能盆地，结构稳定性优于NOS2–苯复合物。平均结合自由能计算显示NOS2与苯和甲苯的结合自由能分别为?9.27和?12.75 kcal mol^-1，表明NOS2蛋白与甲苯的结合亲和力强于苯。

甲苯暴露诱导BV2细胞炎症和氧化应激且可能与NOS2相关： CCK8和LDH检测显示，100 μM甲苯处理24 h和48 h显著降低BV2细胞活力并增加细胞毒性。Western blot和RT-qPCR结果显示，100 μM甲苯处理24 h显著上调NOS2蛋白和mRNA水平。亚硝酸盐检测显示100 μM甲苯显著增加细胞亚硝酸盐水平。炎症因子检测显示100 μM甲苯显著升高TNF-α、IL-1β、IL-6和NF-κB p65的mRNA水平。流式细胞术检测显示100 μM甲苯显著增加细胞内活性氧（ROS）水平。免疫荧光检测显示100 μM甲苯显著增加细胞3-硝基酪氨酸水平。

五、讨论与结论

本研究的讨论部分区分了四个层次的证据：（i）来自网络毒理学和数据库交集的关联性证据；（ii）来自机器学习、分子对接、分子动力学模拟和单细胞虚拟扰动的计算预测；（iii）来自MR的遗传因果推断；（iv）来自体外实验的生物学后果和机制分析。既往研究表明，抑郁症患者外周血中促炎细胞因子（IL-6、TNF-α）水平升高可激活脑内小胶质细胞并诱导iNOS表达；慢性应激小鼠海马iNOS表达增加2–3倍并伴随小胶质细胞活化，而NOS2基因敲除小鼠的抑郁样行为显著缓解。甲苯暴露可增加海马NO水平和NOS活性，通过增加谷氨酸水平导致NOS活性升高、NO产生增多，进而生成大量自由基造成脑组织损伤。细胞因子假说认为炎症反应影响脑内神经发生并干扰神经细胞正常功能，导致抑郁样行为。氧化应激是指ROS产生超过细胞内抗氧化系统清除能力的病理状态，抑郁症患者血浆和脑组织中氧化应激生物标志物水平显著异常。本研究通过整合计算预测、遗传关联、网络扰动和细胞验证，表明NOS2可能是连接空气污染暴露与抑郁症的候选分子节点，其潜在机制可能涉及神经炎症和氧化应激。研究结论为空气污染物与抑郁症之间可能的分子机制提供了新的假说和理论线索，但NOS2作为抑郁症因果中介因子的作用仍需进一步的功能实验加以验证。