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对市售生啤 dispensing 的无醇及低醇啤酒的微生物生态系统进行了评估，重点在于识别具有腐败潜力的优势微生物并表征群落结构的变异。研究收集了来自英国诺丁汉12个不同 licensed 场所（accounts）的超过50份样品，代表20款无醇及低醇啤酒（涵
对市售生啤 dispensing 的无醇及低醇啤酒的微生物生态系统进行了评估，重点在于识别具有腐败潜力的优势微生物并表征群落结构的变异。研究收集了来自英国诺丁汉12个不同 licensed 场所（accounts）的超过50份样品，代表20款无醇及低醇啤酒（涵盖7种啤酒风格：拉格（lager）、印度淡色艾尔（India pale ale）、淡色艾尔（pale ale）、小麦（wheat）、拉德勒（radler）、皮尔森（pilsner）和琥珀艾尔（amber ale）；以及17个品牌）。细菌和真菌的鉴定通过第三代测序技术实现，采用基于扩增子的纳米孔测序（Oxford Nanopore Technologies）。样品分析表明，醋杆菌属（Acetobacter）、酒香酵母属（Brettanomyces）和酵母菌属（Saccharomyces）为核心微生物组成员。样品采集自哪个场所被证明拥有独特的微生物群落，并且是决定微生物群落结构的主导因素，解释了72.6%的变异。这是首次应用第三代测序技术分析生啤无醇及低醇啤酒的研究。研究结果强调了生啤产品易受微生物腐败影响的脆弱性，并突出了实施严格卫生控制（重点关注生啤管线、龙头、keg 连接器和喷嘴）的重要性，尤其是在 dispensing 微生物敏感性较高的无醇及低醇饮品时。
论文主体解读
研究背景与意义
传统啤酒因其固有的抑菌特性——包括营养匮乏、酒花苦味酸（iso-alpha acids，约17–55 ppm）、低pH值（约3.9–4.4）、低氧含量（<0.1 ppm）、高浓度二氧化碳（2–2.5 v/v）以及乙醇的存在（4–8% ABV）——长期以来被视为微生物学上稳定的产品。然而，酒精饮料行业目前正经历对标准产品类型的无醇及低醇（NoLo）变体的需求增长。在无醇及低醇啤酒中，乙醇的缺失或减少，加之可发酵糖可利用性的增加，削弱了其抗菌系统，从而改变了微生物生态位。这使得产品本质上更易发生微生物腐败，允许一系列微生物（包括那些通常与啤酒无关的微生物）的存活和生长。
在酿造实践中，NoLo啤酒通常在与标准啤酒相同的设施中生产，使用大致相同的原料和工艺步骤。传统上，微生物控制发生在啤酒厂内部，通过采用密闭容器和高效的就地清洗（cleaning-in-place，CiP）系统实现。然而，目前大多数NoLo啤酒主要以小包装形式（罐装或瓶装）销售，但消费者对这些饮品在生啤形式上的需求正在增加。这给行业带来了挑战，因为在许多国家（包括英国），生啤通常使用“长距离输送”（long draw）或“长管线”（long line）系统 dispensing，这些系统由个体经营者维护和管理，不受酿酒商控制。生啤 dispensing 系统几十年来一直被认为是腐败的来源，这些系统内存在氧进入和温度波动的机会，加之啤酒残留物的存在，可能有利于微生物生长。此前研究已表明，超过一半的生啤无醇及低醇啤酒样品因微生物生长而处于“不可接受”的质量水平。
为了全面捕捉复杂多变系统中的微生物多样性，超越传统培养方法的技术已被证明是有用的。下一代和第三代测序（NGS/TGS）技术已实现对各种环境中微生物群落的全面分析。在TGS平台中，MinION纳米孔测序仪（Oxford Nanopore Technologies，ONT）最近已被验证可用于啤酒厂环境中啤酒腐败细菌和酵母的鉴定。基于测序的微生物组数据不仅可用于识别系统中存在的微生物，还可用于比较样本内和样本间的微生物群落结构，这通常通过α多样性和β多样性指标实现。
此前，研究人员开展了一项调查，以检查使用生啤系统 dispensing 的NoLo啤酒的质量。在当前研究中，对相同样品进行了微生物组成和多样性评估。该研究首次应用第三代测序技术分析生啤无醇及低醇啤酒的微生物组，实现了对微生物群落的定量和定性评估，旨在评估生啤NoLo产品中存在的微生物群落，并识别解释群落结构变异的关键因素。
主要技术方法
研究人员从2025年1月至4月期间，在英国诺丁汉12个不同的 licensed 场所（accounts）购买了20款市售无醇及低醇啤酒，共收集49份样品，涵盖7种啤酒风格、17个品牌。样品经4°C冷藏过夜后，在30°C下静态培养96小时（“强制培养”）以促进微生物生长。随后进行离心收集沉淀，采用Zymo Research的Quick-DNA? Fecal/Soil Microbe Miniprep Kit提取DNA。真菌ITS区域使用SSU515Fngs-F和LR5-R引物对扩增，细菌16S rRNA基因使用27F和1492R引物对扩增。扩增产物经纯化后，使用ONT Native Barcoding Kit 24 V14制备条形码文库，在PromethION R10.4.1M流动池上运行测序。序列数据通过EPI2ME? wf-metagenomics nextflow工作流程进行分析，使用kraken2分类器与NCBI 16S_18S_28S_ITS数据库进行物种分类。统计分析使用R软件，包括Kruskal-Wallis检验评估α多样性差异，PERMANOVA检验评估β多样性差异。
研究结果
测序分析
所有样品均成功扩增出细菌（约1.5 kb）和真菌（约3.5 kb）目标片段，凝胶电泳显示清晰一致的条带。每个扩增子池生成了超过200,000条reads，长度范围110–11,500 bp，质量分数>9，经EPI2ME过滤后质量分数>10的reads用于后续分类分析。高reads深度和一致的扩增子质量为下游分类和多样性分析提供了足够的分辨率。
生啤无醇及低醇啤酒微生物组的分类组成
样本水平变异性
通过纳米孔测序分析了12个不同场所的生啤无醇及低醇啤酒微生物组，共检测到7个门、87个属和207个物种。所有样品中均未检测到致病微生物（包括大肠杆菌（Escherichia coli）和沙门氏菌属（Salmonella）物种）。流行度-丰度图揭示了清晰的微生物属分组模式：少数属既频繁出现又高丰度（核心微生物组），部分属零星出现但丰度较高（样本特异性污染事件），大多数属检测频率低且丰度低（稀有或瞬时分类群），以及少数属频繁检测但丰度低（持久性次要群落成员）。核心微生物组成员包括醋杆菌属（Acetobacter）、酒香酵母属（Brettanomyces）和酵母菌属（Saccharomyces），均在超过70%的生啤样品中持续存在。样本间在属和种水平均表现出明显变异性，部分样本由少数属主导，如葡糖杆菌属（Gluconobacter）、奥加氏酵母属（Ogataea）和酵母菌属（L4），或酒香酵母属和左旋乳杆菌属（Levilactobacillus）（W20）；其他样本则包含多种腐败相关属的混合群落。物种水平数据确认了这些模式，如W20中酒香酵母属的优势对应B. anomalus和B. bruxellensis的相对丰度升高，而酵母菌属主导的样本含有S. cerevisiae和S. uvarum。醋杆菌属高负荷样本通常由一或两种物种驱动，最常见的是A. oryzoeni和A. sicerae。
场所水平变异性
按场所聚合属级相对丰度揭示了样本水平分析中不明显的模式，突出了不同贸易场所间微生物组成的明显差异。大多数场所中醋杆菌属、酒香酵母属和酵母菌属是优势属，但场所11缺乏醋杆菌属，而是由葡糖杆菌属、酵母菌属和奥加氏酵母属主导。场所4表现出最广泛的 detectable 属范围，表明更多分类学上混合的群落。配对啤酒样本（L1A/L1B和A17A/A17B）尽管是相同产品，但采自不同场所时微生物谱存在差异，主要由醋杆菌属、葡糖杆菌属和左旋乳杆菌属相对丰度的变化驱动。
微生物组多样性概况
α多样性指标用于描述场所内的微生物丰富度和均匀度。观察到的丰富度在场所间存在差异，场所4表现出最高丰富度但样本间变异性也最大；场所5、8和10报告了最低丰富度值。Shannon多样性指数显示场所间中等变异，场所1、4和6表现出更均衡的分类群分布，而场所3、5、7和8的较低Shannon多样性反映了由少数分类群主导的不均匀群落。Simpson多样性进一步强化了这一模式。Kruskal-Wallis检验发现场所间在观察丰富度（p = 0.274）、Shannon多样性（p = 0.221）或Simpson多样性（p = 0.525）方面均无统计学差异。
β多样性分析使用Bray-Curtis相异度并通过主坐标分析（PCoA）可视化。总体上，样本按采样场所分离，尽管这种模式的强度和聚类在不同场所间有所变化。场所3和7的样本紧密聚类，表明微生物群落组成相似；而场所1、4和6的样本在排序空间中更分散，表明场所内变异更大。配对样本（L1A/L1B和A17A/A17B）在图中相邻但不紧密聚类，表明产品身份本身不能完全解释微生物群落结构。PERMANOVA分析表明，乙醇浓度、啤酒风格和生产方法单独检验时均不能显著解释微生物群落结构（p > 0.05），而采样场所本身可解释72.6%的变异（p = 0.01）。
讨论与结论
研究人员识别出的许多优势分类群是公认的反复出现的啤酒腐败微生物，包括醋杆菌属、乳杆菌属（Lactobacillus）、片球菌属（Pediococcus）、酵母菌属和酒香酵母属物种，这些微生物与生啤 dispensing 系统中的生物膜相关。物种水平分辨率进一步强化了这一解释，优势模式经常由Brettanomyces anomalus、Brettanomyces bruxellensis、Levilactobacillus brevis（基名Lactobacillus brevis）和S. cerevisiae驱动。值得注意的是，乳酸菌（LAB）被认为是酿造中最显著的革兰氏阳性腐败细菌，据信占所有报道啤酒腐败案例的60–70%。其中，L. brevis和S. paracollinoides是本研究检测到的最丰富物种之一，作为异型发酵LAB，它们能够产生乙酸、乙醇、双乙酰和二氧化碳，导致酸化、浑浊、黄油异味和涌出现象。
醋酸菌（AAB）是革兰氏阴性需氧细菌，常与生啤相关。本研究检测到28种醋杆菌属、9种葡糖杆菌属和2种葡糖醋杆菌属（Gluconoacetobacter）物种。最丰富的醋杆菌属物种A. oryzoeni和A. sicerae此前未与啤酒关联，通常更常见于富含糖的发酵环境，其对果糖、山梨醇和甘油作为单一碳源的利用能力表明它们适应高糖生态位，这可能赋予它们在无醇及低醇啤酒中的选择性优势。
酒香酵母属酵母（特别是B. anomalus和B. bruxellensis）是本研究整体上最普遍的生物，它们产生乙酸和一系列挥发性酚类化合物，包括4-乙基愈创木酚（4-EG）和4-乙基苯酚（4-EP），导致特征性的“酚类异味”（POF）。B. bruxellensis被鉴定为所有NoLo样本中最丰富的物种。酵母菌属酵母中，非驯化的Saccharomyces菌株通常被认为是最成问题的啤酒酵母污染物，包括含有STA1（葡糖淀粉酶）基因的糖化亚种（S. cerevisiae var. diastaticus），它们能够利用残余碳水化合物，导致过度衰减、过度碳酸化和“酒体”减弱。Saccharomyces uvarum也被检测到，这种酵母通常与葡萄酒和苹果酒发酵相关，其耐冷特性可能有助于其在英国生啤系统中的存在。
场所水平因素驱动微生物变异性。尽管α多样性指标显示场所间差异有限，但β多样性分析揭示了群落组成的显著变化。PCoA分析表明样本主要按场所聚类，支持场所特定因素对微生物组组成施加强烈影响的观点。配对样本的差异进一步表明，尽管啤酒基质有助于微生物群落组成，但场所特定因素在生啤无醇及低醇啤酒微生物组中引入了可测量的变异。这些场所特定的储库可能反映了个体 dispensing 系统内建立的微生物群落差异，包括啤酒管线、龙头或其他接触表面中的生物膜。
该研究首次提供了生啤无醇及低醇啤酒中微生物群落的扩增子测序表征。跨样本，醋杆菌属、酒香酵母属和酵母菌属物种持续作为生啤无醇及低醇啤酒微生物组的核心成员出现。微生物群落按场所强烈聚类，表明生啤管线卫生、清洁频率和处理操作等实践是 on-trade 污染模式的关键驱动因素。这些发现强调了严格卫生处理生啤无醇及低醇产品的必要性，特别是在长管线 dispensing 系统中。预计定制的清洁方案，加上一致有效的卫生维护实践，可能在降低NoLo啤酒微生物污染风险方面发挥关键作用，确保产品质量和消费者满意度。
