CD161表达与结核病及CD161–LLT1阻断的功能效应研究

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：CD161 expression in tuberculosis and functional effects of CD161–LLT1 blockade

　　

摘要 引言：CD161（KLRB1）是一种C型凝集素样免疫受体，表达于多种免疫细胞亚群，具有依赖特定情境的免疫调节功能。 方法：研究人员制备了人抗CD161单克隆抗体，建立了定制化的内部夹心ELISA用于检测可溶性CD161（sCD161），并鉴定出可阻断CD161–LLT1相互作用的抗体。在一项单中心横断面队列研究中，研究人员评估了63例未经治疗的活动性肺结核（TB）患者、52例健康对照（HCs）、6例社区获得性肺炎（CAP）患者及5例潜伏性结核感染（LTBI）者的血浆sCD161水平。对57例TB患者和27例HCs进行了膜型CD161阳性细胞频率的检测。同时检测了肺及淋巴结组织中CD161的分布，并在ESAT6-CFP10抗原刺激的外周血单个核细胞（PBMC）体系中评估了CD161–LLT1阻断对细胞因子应答的影响。 结果：TB患者血浆sCD161水平升高，尤其是依据影像学标准判定为重症的患者，且与部分膜型CD161阳性T细胞频率呈弱负相关。CD161染色在肉芽肿周围区域增强，在坏死区域减弱。阻断CD161–LLT1可改变细胞因子分泌，在特定抗体条件下IFN-γ、IL-6和TNF水平降低，而IL-17A水平升高。 讨论：上述发现表明，在该队列中循环sCD161与TB及影像学疾病严重程度相关，而CD161–LLT1阻断在抗原刺激的PBMC体系中可调节细胞因子应答。仍需更大规模、独立验证及纵向研究，以确定sCD161在诊断和治疗监测中的价值，并阐明CD161–LLT1信号在TB中的细胞机制。

一、研究背景与科学问题

结核病（Tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）引起的慢性传染病，仍是全球重大公共卫生威胁。Mtb为胞内病原体，可诱导肉芽肿形成。宿主适应性免疫有效时，成熟肉芽肿可控制感染；而免疫控制不足则可破坏肉芽肿结构，导致活动性或播散性TB。TB发病机制反映了Mtb与宿主先天及适应性免疫应答，尤其是T细胞介导免疫之间的动态相互作用。

CD161（KLRB1），又称NKR-P1A，是一种II型跨膜C型凝集素样受体，表达于NK细胞和T细胞亚群，具有依赖情境的免疫调节功能。CD161与其配体LLT1（CLEC2D）结合可调节细胞毒性和细胞因子产生，但功能结局取决于免疫细胞亚群和激活环境。在肿瘤中，CD161/LLT1已成为备受关注的免疫调节轴，实验性阻断策略主要在临床前水平探索。在慢性病毒感染中，LLT1–CD161轴的扰动与NK细胞表型和功能改变相关，提示其生物学效应在不同感染情境中可能不同。

在TB中，外周血T细胞CD161表达已被研究作为区分健康个体、LTBI和活动性TB的潜在手段。CD161?T细胞可产生IFN-γ、TNF-α、IL-17A和穿孔素，并能抑制细胞内分枝杆菌生长，但这些应答在TB患者中受损。然而，CD161在外周血和组织中的分布、膜型与循环型CD161的关系，以及CD161–LLT1阻断在TB中的功能后果仍未完全阐明。

研究人员假设活动性TB与膜型和循环型CD161改变相关，且循环sCD161与临床/影像学疾病严重程度相关；进一步假设干扰CD161–LLT1相互作用可改变Mtb抗原刺激的PBMC体系中的细胞因子应答。为验证这些假设，研究人员制备了抗人CD161单克隆抗体，建立了定制化夹心ELISA，检测了外周血和TB相关组织中的CD161表达，并评估了选定的CD161阻断抗体对ESAT6-CFP10刺激后细胞因子产生的影响。

二、研究内容与主要结论

该单中心横断面队列研究共招募77例未经治疗的活动性肺结核患者。血浆sCD161检测覆盖52例HCs、6例CAP患者、5例LTBI者和63例TB患者；膜型CD161阳性细胞频率检测覆盖57例TB患者和27例HCs。组织学分析采用5例肺结核患者肺组织和5例TB患者淋巴结标本。主要结论如下：TB患者血浆sCD161水平高于HCs，重症TB患者sCD161水平显著高于HCs、CAP患者及轻症TB患者；TB患者外周血CD161?/CD3?T细胞、CD161?/CD3?CD4?T细胞和CD161?/CD3?Vδ2?T细胞频率低于HCs；血浆sCD161与CD161?/CD3?T细胞和CD161?/CD3?CD8?T细胞频率呈弱负相关；CD161染色在肉芽肿周围区域增强，在坏死区域减弱；阻断CD161–LLT1可改变细胞因子分泌，表现为IFN-γ、IL-6和TNF降低而IL-17A升高。

三、主要关键技术方法

研究人员通过以下关键技术方法开展研究：以重组人CD161-Fc蛋白免疫BALB/c小鼠，经杂交瘤技术制备抗人CD161单克隆抗体，并以流式细胞术筛选与CD161/L929细胞及人外周血细胞反应的阳性克隆；建立定制化内部夹心ELISA检测血浆sCD161，以14G12为捕获抗体、生物素化5G6为检测抗体；采用流式细胞术检测外周血各淋巴细胞亚群中CD161阳性细胞频率；采用免疫组织化学和免疫荧光分析肺及淋巴结组织中CD161的空间分布；通过ELISA筛选阻断CD161-Fc/LLT1-Fc结合的单克隆抗体；在ESAT6-CFP10抗原刺激的PBMC体系中，以CBA试剂盒检测IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IFN-γ和TNF水平。样本来源于苏州第五人民医院（苏州大学附属传染病医院），于2023年5月至11月招募。

四、研究结果

（一）抗CD161单克隆抗体的表征及定制化sCD161 ELISA的建立

经三轮亚克隆，共获得14株IgG型抗人CD161单克隆抗体克隆。其中5株抗体可通过流式细胞术检测CD161/L929细胞和人外周血细胞上的CD161，3株可在免疫组化中识别CD161。14G12和5G6两株抗体显示非相同竞争模式，分别被选为定制化sCD161 ELISA的捕获和检测抗体。该检测对重组CD161具有特异性，对sCD4、sCD8和sCD25无交叉反应，校准范围为0.0156–1 ng/ml，R2=0.9996。

（二）血浆sCD161与TB及影像学疾病严重程度相关

与HCs相比，TB患者血浆sCD161水平升高（109.3 ± 32.40 vs. 135.2 ± 50.73，P=0.0131）。重症TB患者sCD161水平高于HCs（144.7 ± 53.54 vs. 109.3 ± 32.40，P=0.0019）和CAP患者（144.7 ± 53.54 vs. 100.6 ± 13.12，P=0.0202），轻症TB与HCs间差异不显著。重症TB患者sCD161水平亦高于轻症TB患者（144.7 ± 53.54 vs. 115.0 ± 37.79，P=0.0299）。亚组分析显示，伴有空洞病变、其他肺部影像学异常、肺外TB或合并其他肺部病原体感染的TB患者sCD161水平均高于HCs。

（三）TB患者外周血CD161阳性T细胞频率降低

TB患者CD161?/CD3?T细胞、CD161?/CD3?CD4?T细胞和CD161?/CD3?Vδ2?T细胞频率均低于HCs（21.3% vs. 13.8%，P=0.0005；13.4% vs. 10.4%，P=0.004；69.97% vs. 60.03%，P=0.038）。重症TB与CD161?/CD3?和CD161?/CD3?CD4?T细胞频率降低相关，轻症TB显示CD161?/CD3?CD4?T细胞减少。HC与TB组间CD161?/CD3?CD8?T细胞频率无显著差异。

（四）血浆sCD161与部分膜型CD161阳性T细胞频率呈弱负相关

血浆sCD161与CD161?/CD3?T细胞频率（r=?0.26，P=0.02）和CD161?/CD3?CD8?T细胞频率（r=?0.22，P=0.04）呈弱负相关。与CD161?/Vδ2?T细胞和CD161?/CD56?细胞的关联为负向但未达统计学显著（r=?0.20，P=0.08；r=?0.19，P=0.10），与CD161?/CD3?CD4?T细胞无关联（r=?0.02，P=0.85）。

（五）TB肺及淋巴结病变中CD161的空间分布

CD161免疫组化显示，肉芽肿周围肺组织CD161染色高于非病变参考肺组织，坏死区域CD161染色低于肉芽肿区域。淋巴结中观察到相似的空间模式。免疫荧光显示，肉芽肿周围肺和淋巴结组织中CD3?CD161?和CD8?CD161?T细胞比例高于非病变参考组织。

（六）CD161阻断抗体的鉴定

多个单克隆抗体在ELISA中抑制重组CD161-Fc/LLT1-Fc结合。竞争性检测鉴定出13A1、13A9和10A3为阻断抗体，抑制呈剂量依赖性。10A3和13A1被选为下游细胞实验的代表性阻断抗体。

（七）CD161–LLT1阻断改变ESAT6-CFP10抗原刺激PBMC体系中的细胞因子应答

ESAT6-CFP10刺激增加IL-6、IL-17A、IFN-γ和TNF分泌，IL-4和IL-10无显著变化。在阻断抗体存在下，克隆10A3降低IL-6和TNF同时升高IL-17A，克隆13A1降低IL-6、IFN-γ和TNF同时升高IL-17A。

五、讨论与结论

外周血CD161?/CD3?CD4?和CD161?/CD3?Vδ2?T细胞频率在TB中降低，与既往活动性疾病期间CD161阳性T细胞区室改变的报告一致。循环sCD161升高及其与部分膜型CD161阳性T细胞频率的弱负相关提示膜型和可溶性CD161可能存在生物学联系，但本研究未直接确定血浆分析物的来源或证明蛋白水解脱落机制。近期一项原发性胆汁性胆管炎研究提供了支持sCD161潜在蛋白水解脱落机制的证据：ADAM10/ADAM17的药理抑制可降低培养上清中sCD161释放并增加多种免疫细胞亚群表面CD161表达，为循环sCD161与膜型CD161表达之间的负相关提供了生物学上合理的解释。CD161染色富集于肉芽肿周围组织并在坏死区域减少，提示CD161阳性细胞与肉芽肿组织存在空间关联，但属于描述性发现而非特定趋化因子程序介导的募集证据。功能实验表明CD161–LLT1阻断可改变ESAT6-CFP10激活PBMC中的细胞因子分泌，但未确立对Th1或Th17细胞的直接调控。

研究结论：在该单中心横断面队列中，循环sCD161与活动性TB及影像学疾病严重程度相关，而CD161–LLT1阻断可调节抗原刺激PBMC体系中的细胞因子应答。研究存在若干局限性：CAP和LTBI组样本量小；缺乏独立验证队列和纵向随访；严重程度定义主要基于影像学标准；血浆sCD161的细胞来源和分子身份未直接确定；功能检测在整体PBMC中进行，未进行亚群特异性细胞因子测量。此外，本研究未证明CD161/LLT1阻断的治疗效果或治疗获益。未来需要更大规模的多中心纵向研究、包含更大疾病对照队列、经过验证的分析方法、sCD161的直接分子表征以及亚群特异性功能实验，以确定该通路在TB中的临床价值和机制。