肝细胞癌叶酸代谢相关预后特征模型的构建与验证

《Frontiers in Genetics》：A folate metabolism-related prognostic signature for predicting survival in patients with hepatocellular carcinoma

　　

背景： 肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）具有高度异质性，可靠的分子预后生物标志物仍然有限。叶酸代谢（folate metabolism）参与核苷酸合成、甲基供体生成和氧化还原稳态维持，但叶酸代谢相关基因（folate metabolism-related genes，FAMGs）在HCC中的预后价值仍不清楚。 方法： 在TCGA-LIHC队列中进行FAMGs的差异表达和功能富集分析。采用单变量Cox回归和弹性网络Cox回归（Elastic Net Cox regression）构建预后模型，并通过Bootstrap重采样和LIRI-JP及GSE10141外部队列验证模型性能。采用SHapley Additive exPlanations（SHAP）进行模型解释。利用CIBERSORT、ssGSEA、IPS、TIDE和oncoPredict评估免疫特征和预测药物反应。对模型外候选基因GSS，进一步通过单细胞转录组分析和体外实验进行验证。 结果： 共鉴定出974个差异表达FAMGs，筛选出231个预后相关候选基因并构建了20基因模型。该模型在TCGA-LIHC中的C指数为0.767（95% CI，0.718–0.815），经999次Bootstrap重采样后乐观校正C指数为0.676。EPO、MYCN、PPAT、PON1和PRDX1的全局SHAP重要性最高。外部验证显示在LIRI-JP中具有预后判别能力（C指数=0.735），但在GSE10141中表现有限（C指数=0.495）。不同风险组的免疫相关特征和预测药物敏感性存在差异，而TIDE预测的免疫检查点抑制剂反应率无显著差异。尽管GSS未纳入最终模型，但GSS高表达与较差预后相关。单细胞分析显示恶性肝细胞中GSS表达升高且GSS阳性细胞比例增加。体外实验中，GSS敲低抑制HCC细胞增殖、迁移和侵袭，而过表达则产生相反效应。 结论： 研究构建了HCC的20基因FAMG相关预后模型，该模型在不同外部队列中表现不一，提示需进一步验证。GSS可能促进HCC恶性表型，值得进一步机制研究。

肝细胞癌叶酸代谢相关预后特征：从风险分层到候选基因功能验证

一、研究背景与问题提出

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占原发性肝癌的90%以上，全球发病率持续上升，5年生存率不足20%。尽管手术切除、局部消融、经动脉化疗栓塞、系统性靶向治疗和免疫治疗等治疗手段不断丰富，但患者治疗反应的显著差异暴露出当前基于解剖学分期系统（如TNM或BCLC）的局限性——这些系统难以充分捕捉疾病的分子异质性，阻碍了个体化治疗策略的精准指导。因此，迫切需要能够有效预测预后并指导治疗的分子工具。

叶酸代谢（folate metabolism，FAM）是一碳代谢网络的核心组成部分，通过提供一碳单位参与嘌呤和胸苷酸合成、甲基供体生成及细胞氧化还原稳态维持，从而支持细胞增殖和代谢稳态。异常FAM已被认为与肿瘤细胞的代谢重编程密切相关。流行病学研究提示较低的叶酸水平与肝损伤及HCC风险增加相关。既往研究虽已基于免疫相关基因和广义代谢相关基因构建了多种HCC预后特征，但针对FAMGs的表达异常、预后关联、免疫特征及候选基因生物学功能的系统性整合研究仍相对有限。基于此，研究人员开展本研究，旨在从预后风险分层和候选基因功能探究两个层面，阐明FAMGs相关分子特征与HCC预后异质性和恶性表型之间的联系。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员从GeneCards数据库获取2043个FAMGs，以TCGA-LIHC队列（371例肿瘤样本、50例正常对照，其中318例具有完整生存信息）作为训练集，以LIRI-JP队列（68例）和GSE10141队列（62例可进行预后分析）作为独立外部验证集，以GSE149614单细胞数据集（10例HCC、8例正常对照）进行单细胞水平分析。主要技术方法包括：利用limma包进行差异表达分析（BH法控制FDR，padj < 0.05且|log2FC| > 0.5）；采用clusterProfiler包进行GO和KEGG富集分析；通过单变量Cox回归（BH校正后p.adjust < 0.05）筛选预后相关基因，继而采用弹性网络Cox回归（Elastic Net Cox regression，α = 0.9，λ.min = 0.056，10折交叉验证优化参数）构建预后模型；通过999次Bootstrap重采样评估模型内部稳定性；采用SHAP分析量化各基因对模型预测的贡献；利用CIBERSORT、ssGSEA、IPS、TIDE和oncoPredict评估免疫特征和预测药物反应；通过inferCNV识别恶性细胞；并通过体外实验（siRNA敲低和质粒过表达）验证候选基因GSS的功能。

三、主要研究结果

3.1 鉴定HCC中的差异表达FAMGs

在TCGA-LIHC队列中鉴定出974个差异表达FAMGs（DE-FAMGs），其中753个上调、221个下调。火山图和热图展示了整体差异表达模式及Top 10 DE-FAMGs的表达特征。

3.2 DE-FAMGs的功能和通路富集分析

GO分析显示DE-FAMGs主要富集于DNA复制、DNA重组、DNA双链断裂修复、端粒组织和维持、对外源化合物/氧化应激/低氧的反应等生物学过程。KEGG分析显示主要涉及肝细胞癌、细胞周期、HIF-1信号通路、p53信号通路、同源重组及DNA修复相关通路，同时也富集于叶酸介导的一碳代谢池、叶酸转运与代谢、抗叶酸耐药和卟啉代谢等通路。

3.3 预后风险模型构建与SHAP解释

单变量Cox回归筛选出231个预后相关基因，弹性网络Cox回归最终确定20个基因构建预后模型。其中PON1、LCAT和SERPINF2的回归系数为负，其余17个基因为正。训练集C指数为0.767（95% CI：0.718–0.815），LASSO Cox模型选择相同20个基因且C指数为0.766。999次Bootstrap重采样后校正C指数为0.676，乐观度为0.090，中位保留变量数为37。最终模型EPV为5.4，提示仍存在一定过拟合风险。SHAP分析显示EPO、MYCN、PPAT、PON1和PRDX1的全局重要性最高；对最高风险患者（TCGA-G3-A7M9）的局部SHAP分析显示MYCN（+0.696）、EPO（+0.435）、PON1（+0.301）和PPAT（+0.241）是驱动其高风险评分的主要基因。20个模型基因的GO-BP富集分析显示主要涉及细胞对化学应激的反应、MAPK和ERK1/ERK2信号级联的正向调控、激酶活性调控和miRNA代谢过程调控等。

3.4 预后分层与模型验证

PCA、UMAP和t-SNE降维分析显示高低风险组呈现不同分布模式。Kaplan-Meier分析显示TCGA-LIHC训练集和LIRI-JP外部验证集中高风险组总生存期显著较差，而GSE10141队列中组间生存差异未达统计学意义（log-rank P = 0.093），C指数为0.495。多变量Cox回归确认风险评分为独立预后因素（HR = 4.14，95% CI 2.90–5.92，p < 0.001）。训练集1、3、5年时间依赖AUC分别为0.862、0.768和0.737，5年AUC（0.74）高于临床分期（0.64）、年龄（0.55）和性别（0.46）。LIRI-JP队列C指数为0.735（95% CI：0.615–0.854），1年和3年AUC分别为0.718和0.739。基于风险评分和临床变量构建的列线图显示出良好的校准性能。研究指出GSE10141采用基于FFPE样本的DASL 6K平台，而LIRI-JP和TCGA-LIHC均采用RNA-seq技术，平台差异可能影响跨队列预测性能。

3.5 免疫细胞浸润模式差异

CIBERSORT分析显示22种免疫细胞中有8种细胞类型的浸润比例在高低风险组间存在显著差异（FDR < 0.05）：高风险组中M0巨噬细胞、活化CD4记忆T细胞、滤泡辅助T细胞（Tfh）、静息树突状细胞和调节性T细胞（Tregs）比例较高，而低风险组中静息CD4记忆T细胞、单核细胞和静息肥大细胞比例较高。ssGSEA分析显示29个免疫相关特征中有10个存在显著差异：高风险组巨噬细胞、Tregs、活化树突状细胞（aDCs）、未成熟树突状细胞（iDCs）、MHC I类分子和抗原呈递细胞共刺激（APC共刺激）评分较高，低风险组肥大细胞、NK细胞和I型及II型干扰素反应评分较高。

3.6 不同风险组免疫特征和预测药物敏感性差异

免疫亚型分布在高风险组和低风险组间显著不同（χ2检验，P = 6.2 × 10??），高风险组中IFN-γ优势和伤口愈合亚型比例增加，低风险组中炎症性和淋巴细胞亚型比例增加。IPS分析显示低风险组总体IPS及IPS-CTLA4、IPS-PD1、IPS-PD1+CTLA4评分均显著高于高风险组。TIDE分析显示高风险组总体TIDE评分和T细胞功能障碍评分较低，但T细胞排斥评分较高；TIDE预测的免疫检查点抑制剂应答率在两组间无显著差异（84.9% vs 82.4%，P = 0.650）。药物敏感性预测显示198种药物中有123种的预测敏感性在组间存在显著差异（FDR < 0.05），高风险组对GDC0810、Taselisib、Dasatinib、BDP-00009066和Fulvestrant的预测IC₅₀较低，低风险组对PLX-4720、PF-4708671、JAK1_8709、SB505124、TAF1_5496、JQ1和OF-1的预测IC₅₀较低。

3.7 GSS的预后关联和表达特征及其与风险模型的关系

GSS（编码谷胱甘肽合成酶）属于预定义FAMGs集合，在差异表达分析中显著上调（log2FC = 0.81，P = 6.4 × 10?2?），单变量Cox回归显示其与HCC患者总生存显著相关（HR = 1.369，95% CI：1.132–1.657，FDR = 0.0067）。TCGA-LIHC和LIRI-JP队列中GSS高表达均与较差总生存相关。GSS表达与模型风险评分显著正相关（Spearman r = 0.47），与PSMA7（r = 0.59）、DTYMK（r = 0.49）、PRDX1（r = 0.41）、TALDO1（r = 0.39）和GPX4（r = 0.30）显著正相关。尽管GSS未纳入最终20基因模型（加入后Wald P = 0.568，似然比检验P = 0.567，C指数仅从0.767增至0.768），但基于其预后关联和生物学意义，研究人员将其选为模型外候选基因进行功能验证。

3.8 GSS在HCC恶性肝细胞中高表达并与不良预后相关

对GSE149614单细胞数据集进行质量控制后鉴定出24个细胞簇，注释为12种细胞类型。inferCNV分析以正常组织来源的肝细胞为参考基线，将高CNV评分细胞定义为恶性细胞，恶性细胞主要富集于肿瘤样本。与无非恶性肝细胞相比，恶性肝细胞中GSS表达显著升高（p < 0.0001），GSS阳性细胞比例从27.1%增至44.1%。TCGA-LIHC队列中GSS高表达与不良总生存显著相关（p = 0.001）。

3.9 GSS在HCC恶性进展中的功能研究

GSS在HCC细胞系（Hep3B、Huh-7、SNU-182）中的mRNA和蛋白表达水平均显著高于正常肝上皮细胞系THLE-2。在Huh-7细胞中敲低GSS显著抑制细胞增殖（CCK-8和EdU实验，p < 0.0001）、迁移和侵袭能力（p < 0.001）；在SNU-182细胞中过表达GSS则产生相反效应。

四、讨论与结论

研究人员指出，FAM是一碳代谢网络的核心组成部分，与核苷酸合成、甲基供体生成、DNA复制和氧化还原稳态密切相关。本研究中DE-FAMGs的功能富集分析显示其主要参与DNA复制与修复、细胞周期、应激反应和代谢相关过程，并富集于叶酸介导的一碳代谢等通路，提示广义FAMGs集合可能与HCC的多种生物学过程相关。20个模型基因的GO-BP分析显示其富集于细胞应激反应和信号调控相关条目，但研究人员强调模型基因来源于广义FAMGs候选集合，功能富集结果不能证明所有模型基因直接参与经典叶酸代谢，该模型更应被解释为基于FAMGs候选集合构建的预后分子特征。

模型在TCGA-LIHC训练集和LIRI-JP外部验证集中表现出预后分层能力，但在GSE10141中表现有限。Bootstrap校正后C指数降至0.676，EPV为5.4，提示模型存在一定过拟合风险，需在更大规模多中心独立队列中进一步验证。GSS作为谷胱甘肽合成关键酶，在特定肿瘤背景下可通过增强GSS介导的GSH合成促进肿瘤细胞适应代谢和氧化应激。本研究中GSS在恶性肝细胞中高表达，体外实验证实其促进HCC细胞增殖、迁移和侵袭，提示GSS可能在维持HCC恶性表型中发挥重要作用，值得进一步机制研究。

结论： 研究人员构建了HCC的20基因FAMG相关预后模型，该模型在TCGA-LIHC和LIRI-JP队列中显示一定的预后判别能力，但在GSE10141队列中表现有限，提示跨平台普适性仍需进一步验证。GSS可能促进HCC恶性表型，值得进一步机制研究。