《Frontiers in Veterinary Science》：Curcumin attenuates combined DON+AFB1 induced apoptosis via Nrf2-associated signaling in porcine alveolar macrophages 3D4/21 cell line: an in vitro study
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脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）和黄曲霉毒素B1（AFB1）是谷物类饲料中最常见的霉菌毒素污染物，且经常同时出现，然而关于二者联合毒性的证据大多来自肝脏、肠道或淋巴模型。肺泡巨噬细胞是猪舍环境中吸入携带霉菌毒素的饲料粉尘后最先接触霉菌毒素的免疫细胞之一，这种呼吸道
脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）和黄曲霉毒素B1（AFB1）是谷物类饲料中最常见的霉菌毒素污染物，且经常同时出现，然而关于二者联合毒性的证据大多来自肝脏、肠道或淋巴模型。肺泡巨噬细胞是猪舍环境中吸入携带霉菌毒素的饲料粉尘后最先接触霉菌毒素的免疫细胞之一，这种呼吸道暴露途径在毒理学上与经口摄入截然不同，此前尚未有研究对DON+AFB1联合暴露在该途径下的效应进行表征。在本项体外研究中，研究人员选用猪肺泡巨噬细胞（PAMs）细胞系3D4/21作为模型，以不同浓度的DON+AFB1联合处理细胞。联合暴露以剂量依赖方式诱导细胞毒性，表现为细胞活力降低、乳酸脱氢酶（LDH）释放升高、Bcl-2/Bax比值受抑以及细胞内活性氧（ROS）蓄积增加。这些变化与内源性凋亡通路的激活一致。姜黄素是一种在中药中广泛使用且具有公认抗氧化活性的天然产物，能够提高细胞活力、减少LDH释放和ROS蓄积，并逆转Bcl-2/Bax/细胞色素c（Cytochrome c）和Caspase-3表达中的凋亡性偏移。DON+AFB1联合暴露还抑制了Nrf2/HO-1/NQO1抗氧化轴，而姜黄素在mRNA和蛋白水平均恢复了Nrf2、HO-1和NQO1的表达。使用ML385对Nrf2进行药理学抑制后，姜黄素的保护作用减弱，表现为抗氧化基因表达无法恢复、凋亡标志物升高。上述发现表明，Nrf2/HO-1信号通路与姜黄素对抗DON+AFB1诱导的猪肺泡巨噬细胞氧化应激和凋亡变化的保护作用相关，支持进一步评估姜黄素作为猪生产环境中吸入性霉菌毒素联合暴露的候选干预措施。
论文解读
一、研究背景与目的
霉菌毒素是曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）和镰刀菌属（Fusarium）等真菌产生的次级代谢产物，广泛存在于环境中。联合国粮农组织（FAO）估计全球约25%的食品供应受到霉菌毒素污染。脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）和黄曲霉毒素B1（AFB1）是全球谷物、饲料和食品中最常见且难以避免的霉菌毒素污染物。DON主要由镰刀菌属产生，通过结合60S核糖体亚基干扰蛋白质合成，产生核糖体应激、免疫抑制和生长障碍；AFB1由黄曲霉和寄生曲霉产生，被国际癌症研究机构（IARC）列为1类肝致癌物，代谢活化后形成DNA加合物，抑制转录并引发氧化损伤和细胞凋亡。
DON和AFB1在饲料和谷物来源中频繁共存。欧盟监测数据显示，自然污染饲料中AFB1检出水平为0.003–0.042 mg/kg，DON为0.16–0.95 mg/kg，经常接近或超过现行监管限值。既往关于二者联合毒性的研究多集中于肝脏、肠道或淋巴模型，而呼吸道暴露途径在毒理学上区别于经口摄入。猪舍环境中，霉菌毒素可通过吸入处理、碾磨或储存受污染谷物和垫料时产生的气溶胶粉尘进入呼吸道，粉尘样本中已检出黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮。吸入后，霉菌毒素直接作用于呼吸道上皮，AFB1可降低纤毛摆动频率，损害黏液纤毛清除功能；反复AFB1暴露在体内可产生肺泡上皮增生、间质和血管炎症、巨噬细胞浸润及肺组织凋亡增加。然而，DON和AFB1联合暴露是否也在猪肺泡巨噬细胞中诱导氧化损伤和内源性凋亡，此前尚不清楚。
姜黄素是姜黄（Curcuma longa）的主要多酚成分，具有公认的抗氧化、抗炎和抗癌活性，可激活核因子E2相关因子2（Nrf2），进而诱导血红素加氧酶-1（HO-1）等抗氧化酶表达。已有报道姜黄素可减轻其他霉菌毒素（如玉米赤霉烯酮）诱导的氧化损伤，但姜黄素的保护作用是否真正与Nrf2激活相关，抑或Nrf2激活仅为伴随事件，此前缺乏药理学阻断证据。本研究旨在：在猪肺泡巨噬细胞系3D4/21中表征DON+AFB1联合暴露的细胞毒性、氧化应激和内源性凋亡特征，并检验姜黄素是否减轻这些反应；随后使用选择性Nrf2抑制剂ML385检验该保护作用是否与Nrf2信号通路相关。
二、主要技术方法
研究人员选用猪肺泡巨噬细胞系3D4/21（购自中国兽医药品监察所，传代15–20代）作为体外模型。主要关键技术方法包括：MTT比色法检测细胞活力；乳酸脱氢酶（LDH）释放实验评估细胞膜完整性；流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测细胞内活性氧（ROS）水平；硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）含量，氮蓝四唑法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性，钼酸铵法测定过氧化氢酶（CAT）活性；Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1、Bcl-2、Bax、Cytochrome c、Caspase-3及β-actin（内参）的mRNA表达；Western blot检测上述蛋白的表达水平；使用Nrf2特异性抑制剂ML385（5 μM）预处理4小时进行药理学阻断实验。实验设置四组：空白对照、DON（0.5 μg/mL）+AFB1（0.04 μg/mL）联合暴露、姜黄素（2 μM）单独处理、DON+AFB1+姜黄素联合处理，以及加入ML385的验证组。所有实验独立重复三次，数据以均值±标准差表示，采用单因素方差分析和LSD事后检验进行统计比较。
三、研究结果
3.1 DON+AFB1在PAMs中诱导细胞毒性
研究人员以DON（0.25、0.5、1.0、2.0 μg/mL）和AFB1（0.02、0.04、0.08、0.16 μg/mL）配对浓度处理细胞24小时，发现联合暴露以剂量依赖方式降低细胞活力。0.5 μg/mL DON联合0.04 μg/mL AFB1是产生统计学显著活力降低的最低组合浓度，被选为后续实验的工作浓度。姜黄素单独处理在4 μM和8 μM时显著降低细胞活力，故选择2 μM作为保护性工作浓度。姜黄素预处理以剂量依赖方式改善DON+AFB1毒性下的细胞活力，2 μM提供最大保护。DON+AFB1联合暴露增加LDH释放，姜黄素预处理将LDH活性恢复至接近对照水平。
3.2 姜黄素对DON+AFB1诱导氧化应激的影响
DON+AFB1暴露显著升高细胞内ROS水平，姜黄素预处理显著减弱该升高。联合暴露显著升高MDA含量，姜黄素预处理显著降低MDA。DON+AFB1组SOD和CAT活性较对照显著降低，姜黄素预处理恢复二者水平。共聚焦成像显示，对照和姜黄素单独组荧光信号极弱，DON+AFB1处理细胞呈现强烈荧光，姜黄素预处理显著减弱该信号。结果表明姜黄素在PAMs中重建氧化还原稳态以对抗DON+AFB1诱导的氧化应激。
3.3 姜黄素增加PAMs中Nrf2表达
DON+AFB1暴露显著降低Keap1、Nrf2和HO-1的mRNA水平，姜黄素预处理恢复三者表达；NQO1 mRNA在姜黄素预处理组较DON+AFB1组显著升高。蛋白表达呈现相同模式：Nrf2、HO-1和NQO1蛋白在DON+AFB1组降低，姜黄素预处理恢复其表达。结果表明姜黄素通过上调Nrf2/HO-1信号通路保护PAMs免受DON和AFB1诱导的氧化损伤。
3.4 DON+AFB1在PAMs中诱导凋亡
DON（0.5 μg/mL）+AFB1（0.04 μg/mL）联合暴露24小时显著激活线粒体凋亡通路：抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著受抑，促凋亡标志物Bax、Caspase-3和Cytochrome c表达显著升高。姜黄素单独处理维持基线表达模式；姜黄素预处理逆转DON+AFB1诱导的变化，升高Bcl-2并降低Bax、Cytochrome c和Caspase-3。流式细胞术显示DON+AFB1联合处理增加凋亡细胞比例，姜黄素补充显著降低该比例，但仍略高于对照。结果表明姜黄素通过调控线粒体凋亡信号通路减轻DON和AFB1诱导的PAMs凋亡。
3.5 ML385对姜黄素保护作用的影响
在姜黄素处理细胞中加入Nrf2抑制剂ML385后，Bcl-2 mRNA和蛋白水平相对姜黄素组降低，Caspase-3、Cytochrome c和Bax的mRNA和蛋白水平相对姜黄素组升高，凋亡标志物谱向DON+AFB1单独处理组方向回归。结果表明姜黄素在PAMs中的抗凋亡作用依赖于Nrf2信号传导。
3.6 ML385对姜黄素处理PAMs中Nrf2通路的影响
姜黄素处理较DON+AFB1组升高Keap1、Nrf2、HO-1和NQO1的mRNA水平；加入ML385后，四个基因的mRNA水平较姜黄素组显著降低。蛋白水平上，ML385同样下调Nrf2、HO-1和NQO1表达，但水平仍高于DON+AFB1单独处理组。结果表明姜黄素通过激活Nrf2通路应对毒素诱导的ROS，从而减少凋亡和氧化应激，ML385通过抑制Nrf2信号逆转该保护作用。
四、讨论与结论
本研究的贡献在于两方面：一是在猪肺泡巨噬细胞（3D4/21）这一特定细胞类型中表征了DON+AFB1联合暴露的毒性效应；二是使用ML385药理学抑制手段检验了Nrf2信号通路的参与。工作浓度（DON 0.5 μg/mL；AFB1 0.04 μg/mL）对应本实验室此前在3D4/21细胞中确定的联合无可见不良效应水平，并对应小鼠经口无效应剂量（0.1 mg DON/kg和0.01 mg AFB1/kg体重）。讨论部分指出，虽然欧盟法规对猪饲料中AFB1（仔猪配合饲料5 μg/kg，其他猪20 μg/kg）和DON（0.9 mg/kg）设有限值，但全球范围内包括美国、加拿大及许多谷物产区在内，猪特异性DON限值缺失或执行不力，实际饲料调查中DON常超过1 mg/kg、AFB1常超过20 μg/kg，因此本研究的体外浓度在更广泛的暴露范围内具有生物学相关性。讨论同时指出，经口摄入后AFB1经肝脏首过氧化、DON在小肠近端快速吸收，而可吸入饲料粉尘可绕过该过程将原型毒素直接递送至肺泡巨噬细胞，凸显了呼吸道暴露途径的独特性。研究局限性包括：仅在单一细胞系中进行、缺乏原代PAMs或上皮模型验证、急性体外暴露不能反映慢性低水平暴露、未测量吸入剂量和体内浓度、仅深入测试一对毒素浓度和单一姜黄素预处理方案、Nrf2参与仅通过药理学抑制验证。
结论：研究人员证实DON和AFB1联合暴露可在猪肺泡巨噬细胞系（3D4/21）中诱导氧化应激和内源性凋亡，姜黄素可减轻这些效应，该保护作用与Nrf2/HO-1信号通路相关。ML385药理学抑制实验表明，在所测试条件下该保护作用与Nrf2活性相关。这些发现属于初步结果，局限于急性体外模型，不能证明体内或职业性保护作用，仅支持在该细胞类型中进一步开展姜黄素和Nrf2的实验评估。
