免疫球蛋白与Efgartigimod降低原代大鼠皮层神经元培养物的神经元活性

《Frontiers in Cellular Neuroscience》：Immunoglobulins and Efgartigimod reduce neuronal activity in primary rat cortical neuron cultures

　　

摘要 基于免疫球蛋白的疗法越来越多地用于调节神经炎症性疾病，但其是否直接影响神经元功能仍不清楚。在此，研究人员提供了证据表明，原代大鼠皮层神经元同时表达抑制性Fcγ受体IIb（FcγRIIb）和新生儿Fc受体（FcRn），这一结论通过免疫细胞化学和mRNA分析得以证实。在促炎条件下，FcγRIIb表达上调，表明其受炎症依赖性调控。通过微电极阵列（MEA）记录，研究人员观察到免疫球蛋白处理在生理和炎症条件下均降低了神经元活性。同样，Efgartigimod（一种高亲和力FcRn阻断剂）与神经元活性的持续降低相关，且观察到的效应提示在对照条件下存在剂量依赖性趋势。总之，这些发现提供了概念验证性证据，表明原代皮层神经元培养物对免疫球蛋白和Efgartigimod在体外有反应，并凸显了神经元Fc受体信号传导作为未来研究的一个有前景的方向。

一、研究背景与问题

免疫球蛋白是适应性免疫系统的关键组成部分，主要存在于血液循环中，其功能包括中和抗原、通过调理作用促进吞噬、激活巨噬细胞以及启动补体级联反应。静脉注射免疫球蛋白（IVIG）疗法已成为多种自身免疫性和炎症性疾病的确立治疗手段，尤其在神经病学领域，作为吉兰-巴雷综合征、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病（CIDP）以及重症肌无力（MG）加重等免疫介导神经病的一线治疗。IVIG的疗效归因于其广泛的抗炎和免疫调节作用，包括调节Fc受体功能和中和致病性自身抗体。IVIG制剂主要由免疫球蛋白G（IgG）单体组成，其通过可结晶片段（Fc）区域与免疫细胞的Fcγ受体（FcγRs）结合。FcγRIIb是已知唯一的抑制性受体，被认为与IVIG的抗炎效应密切相关。近期研究表明，包括FcγRIIb在内的特定Fc受体不仅表达于免疫活性细胞，还表达于中枢神经系统（CNS）的神经元上，但其功能相关性尚不清楚。此外，IVIG可穿越血脑屏障到达CNS。Efgartigimod alfa作为一种来源于IgG1的Fc片段，通过竞争性结合新生儿Fc受体（FcRn）降低循环自身抗体水平，已在MG和CIDP中显示出疗效。鉴于Fc受体可能在CNS中发挥超越经典免疫功能的作用，本研究旨在探讨神经元Fc受体的表达及其与免疫球蛋白和Efgartigimod作用下神经元网络反应的关系，挑战抗体-受体相互作用仅限于免疫细胞的经典范式。

二、研究内容与结论

研究人员假设原代皮层神经元中FcγRIIb和FcRn的表达受炎症环境影响，且在生理和炎症条件下，暴露于免疫球蛋白和Efgartigimod后神经元活性会发生改变。为验证这些假设，研究人员结合免疫细胞化学、RT-qPCR和微电极阵列（MEA）技术，在原代细胞培养的不同实验条件下分析受体表达和神经元网络反应。研究结果表明，原代大鼠皮层神经元表达FcγRIIb和FcRn；促炎环境显著上调FcγRIIb的免疫反应性和转录水平，而FcRn表达不变。免疫球蛋白处理在生理和炎症条件下均显著降低神经元活性，Efgartigimod alfa同样在两种条件下持续抑制神经元活性，且在对照条件下呈现剂量依赖性趋势。这些发现提供了概念验证性证据，表明神经元Fc受体相关机制可能参与免疫球蛋白和Efgartigimod对神经元网络活性的调节，为神经免疫通讯研究开辟了新方向。

三、关键技术与方法

研究人员采用以下主要技术方法开展研究：1）原代大鼠皮层神经元培养，取材于妊娠18-19天的大鼠胚胎皮层组织；2）小胶质细胞培养及其条件培养基制备，使用脂多糖（LPS）诱导小胶质细胞炎症表型；3）免疫细胞化学染色，使用抗FcγRIIb、抗FcRn和抗MAP2抗体鉴定神经元及受体表达；4）实时定量PCR（RT-qPCR）检测Fcgr2b和Fcgrt基因转录水平；5）微电极阵列（MEA）记录系统，用于测量神经元自发放电活动，记录时间点包括基线、急性期、1小时、4小时和24小时。所有动物实验均符合德国动物保护法规，并获得了相关伦理批准。

四、研究结果

1. 1.
   皮层神经元表达FcγRIIb和FcRn

通过免疫细胞化学染色，研究人员在MAP2阳性的皮层神经元中检测到FcγRIIb和FcRn的免疫反应性，在对照和促炎条件下均有表达。

1. 2.
   炎症环境增加皮层神经元中FcγRIIb免疫反应性

定量分析显示，经LPS处理的小胶质细胞条件培养基刺激后，FcγRIIb免疫反应性显著增加，平均每个神经元62.5个受体，对照组为35.6个，增加1.76倍。而FcRn免疫反应性无显著变化（35.2 vs 34.8）。转录水平分析显示一致模式，Fcgr2b表达强烈上调9.59倍，而Fcgrt无显著变化。

1. 3.
   炎症和免疫球蛋白差异性塑造皮层神经元活性

在4小时时间点，暴露于促炎环境的神经元放电率显著高于对照组（基线的2.4倍 vs 1.2倍），但24小时后两组趋于一致。免疫球蛋白处理在生理条件下强烈降低神经元活性，1小时降至基线的0.3倍，4小时和24小时降至0.1倍。作为额外血浆蛋白对照的白蛋白也降低神经元活性，但程度显著低于免疫球蛋白。在促炎环境中，免疫球蛋白同样显著降低神经元活性。

1. 4.
   Efgartigimod alfa在生理和炎症条件下降低神经元活性

在生理条件下，Efgartigimod alfa处理导致神经元活性立即下降，1.8 mg/ml浓度降至基线0.33倍，3.6 mg/ml浓度降至0.20倍，且抑制持续至少24小时，仅显示轻度可逆性。对照组活性则生理性增加至基线2.12倍。较高浓度下更显著的降低提示对照条件下存在浓度依赖性趋势。在促炎条件下，Efgartigimod alfa同样维持快速且持续的抑制效应，但未观察到一致的浓度依赖性模式。

五、讨论与结论

讨论部分指出，本研究首次报道了促炎环境可增加皮层神经元中FcγRIIb免疫反应性，此前仅在其他情境如淀粉样蛋白-β暴露中观察到类似上调。FcRn在神经元中的表达此前存在争议，本研究通过免疫细胞化学和转录水平检测提供了支持证据，且公开的单细胞转录组数据库分析也支持这一发现。关于炎症对神经元活性的影响，既往研究结果不一致，本研究发现促炎环境可瞬时增强皮层神经元活性。免疫球蛋白和Efgartigimod alfa均降低神经元活性的机制尚不完全清楚，可能与Fc受体介导的细胞内钙升高、钙依赖性钾通道激活及膜超极化有关，也可能涉及FcRn介导的IgG内化过程。研究局限性包括体外使用的药物浓度较高，可能无法反映体内神经元暴露水平，以及培养物中可能存在残留的非神经元细胞。

研究结论：本研究发现提供了体外概念验证性证据，证明皮层神经元表达FcγRIIb和FcRn，且暴露于免疫球蛋白和Efgartigimod后神经元活性发生改变。这项工作揭示了免疫球蛋白信号传导与神经元活性之间此前未被充分探索的界面。在生理和炎症条件下观察到的免疫球蛋白和Efgartigimod效应，为进一步研究神经元Fc受体相关机制对神经免疫通讯的潜在贡献提供了依据。未来需要进一步的体内研究和疾病模型来确定潜在机制并评估其生理和临床相关性。