AMPK/PINK1/Parkin通路相关线粒体质量控制参与硫酸镁对术后认知功能障碍的神经保护作用

《Frontiers in Cellular Neuroscience》：AMPK/PINK1/Parkin pathway-associated mitochondrial quality control contributes to magnesium sulfate-induced neuroprotection in postoperative cognitive dysfunction

　　

摘要翻译：术后认知功能障碍（POCD）与神经炎症和线粒体失调相关，但连接这些过程的机制仍未完全阐明。研究人员探讨了硫酸镁（MgSO?）的神经保护作用，以及AMP活化蛋白激酶（AMPK）/PTEN诱导激酶1（PINK1）/Parkin信号在实验性POCD中的参与。方法：通过异氟烷麻醉下开放胫骨骨折建立小鼠POCD模型，并在脂多糖（LPS）处理的BV2小胶质细胞中建立体外炎症模型。采用行为学测试、酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹、TUNEL染色、JC-1分析和三磷酸腺苷（ATP）测量评估认知功能、炎症反应、线粒体相关代谢改变及通路相关变化。结果：MgSO?改善了术后行为缺陷，降低了海马炎症细胞因子，使小胶质细胞活化相关标志物趋于正常，改善了细胞ATP水平和线粒体膜电位改变，并部分恢复了线粒体动力学相关蛋白变化。POCD或LPS降低了PINK1、Parkin和LC3-II，同时升高p62；MgSO?部分逆转了这些改变。MgSO?还恢复了p-AMPK水平，而药理学AMPK抑制剂Compound C部分减弱了MgSO?对PINK1/Parkin信号、ATP水平、炎症反应、线粒体标志物和行为结局的影响。讨论：这些发现支持AMPK/PINK1/Parkin相关线粒体质量控制参与MgSO?在实验性POCD中神经保护作用的模型。

论文解读：术后认知功能障碍（POCD）是手术和麻醉后出现的认知功能损害综合征，表现为注意力、记忆、执行功能和加工速度等多个认知域受损，可持续数周至数月甚至更久，严重影响患者生活质量并增加医疗负担。老年患者POCD发生率可达30%–40%，且术后数月仍可能存在持续性认知缺陷，而目前能明确改善长期预后的有效干预措施仍十分有限。神经炎症、小胶质细胞过度激活和线粒体功能障碍均被牵涉到POCD的病理过程中。手术应激可激活海马小胶质细胞并增加炎症细胞因子产生，进而促进认知损害。新近研究提示，小胶质细胞炎症状态和线粒体稳态的持续性改变可能延缓认知恢复。PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬已被证明与神经炎症信号的控制有关，而药理学诱导线粒体自噬可改善术后神经炎症和认知功能障碍。线粒体质量控制对维持细胞能量稳态、适应氧化应激和限制炎症信号至关重要。AMP活化蛋白激酶（AMPK）是细胞能量状态的关键传感器，通过调节代谢、线粒体动力学和自噬参与线粒体质量控制。PTEN诱导激酶1（PINK1）/Parkin介导的线粒体自噬是选择性清除受损线粒体的主要途径，该信号通路破坏可导致线粒体DNA积累和炎症通路激活，而增强线粒体自噬可减轻受损线粒体负荷和炎症信号。在小胶质细胞中，线粒体应激可促进炎症激活，提示AMPK/PINK1/Parkin轴可能在POCD中将线粒体质量控制与神经炎症联系起来。硫酸镁（MgSO?）是一种具有长期临床应用历史的药物，在麻醉学和神经病学中广泛使用，包括作为子痫前期/子痫的抗惊厥药和围术期镇痛的辅助药物。MgSO?可能通过N-甲基-D-天冬氨酸受体调节减轻兴奋性毒性，并影响钙信号、炎症通路和神经元能量代谢。体外研究显示MgSO?可抑制脂多糖（LPS）诱导的小胶质细胞炎症介质释放，动物实验提示其可调节小胶质细胞炎症表型和神经炎症。MgSO?还被报道可在兴奋性毒性应激下维持细胞生物能量功能和ATP水平，并在脑损伤模型中改善炎症和线粒体反应。然而，MgSO?在POCD中是否协调调节神经炎症和线粒体质量控制，以及AMPK/PINK1/Parkin信号是否参与这些效应，尚不清楚。因此，该研究在互补的体内和体外POCD相关神经炎症模型中探讨了MgSO?如何影响小胶质细胞炎症反应和线粒体质量控制，并使用药理学AMPK抑制剂Compound C检查AMPK/PINK1/Parkin通路的参与。

研究人员开展了以下研究：在体内实验中，成年雄性C57BL/6J小鼠（8–10周龄，22–25 g）在异氟烷麻醉下接受开放胫骨骨折手术建立POCD模型，MgSO?（50、100、200 mg/kg）于术前30分钟开始每日一次腹腔注射，连续3天。对照组仅接受相应异氟烷麻醉和皮肤切开而不进行骨折操作。在体外实验中，使用LPS（1 μg/mL）刺激BV2小鼠小胶质细胞24小时建立炎症模型，MgSO?（5、10、20 mM）在LPS刺激前预处理2小时。对于AMPK抑制实验，Compound C（体内20 mg/kg，体外10 μM）在MgSO?处理前给予。研究人员采用了多种关键技术方法：行为学测试（包括Morris水迷宫、新物体识别测试、旷场测试）、酶联免疫吸附测定（ELISA）检测炎症细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）和通路蛋白、蛋白质印迹检测蛋白表达、TUNEL染色评估凋亡、JC-1分析检测线粒体膜电位、ATP测定评估能量代谢，以及CD11b磁珠分选分离海马小胶质细胞，同时进行了免疫荧光染色（Iba1、CD68、NeuN、TOMM20、LAMP1）和组织学染色（H&E、Nissl）。

研究结果显示：在MgSO?减轻术后海马神经炎症和线粒体质量控制异常方面，手术显著增加了海马TNF-α、IL-1β和IL-6水平，而MgSO?呈剂量依赖性降低这些炎症反应。蛋白质印迹显示，手术降低CD206和Bcl-2，同时增加CD68、Iba1和Bax，MgSO?部分逆转了这些手术相关改变。手术还与线粒体稳态改变相关，表现为DRP1升高、OPA1和TOMM20降低，MgSO?部分恢复正常。同时，手术降低PINK1、Parkin和LC3-II并增加p62，MgSO?部分逆转该蛋白表达模式。三重免疫荧光染色显示，术后海马小胶质细胞内线粒体-溶酶体共定位减少，MgSO?部分恢复TOMM20-LAMP1重叠。组织学评估显示，手术后海马神经元损伤明显，HE染色见结构破坏增加，Nissl染色显示神经元完整性降低，NeuN免疫荧光证实存活神经元减少，TUNEL染色显示凋亡细胞增加，MgSO?减轻了这些病理改变。在MgSO?恢复p-AMPK和ATP水平并改善神经行为缺陷方面，术后小鼠海马p-AMPK显著降低，MgSO?恢复其水平；海马ATP水平在术后降低，MgSO?处理后呈剂量相关恢复。Morris水迷宫测试中，手术增加逃避潜伏期和错误次数，MgSO?改善两者；新物体识别测试中，手术减少探索时间和辨别率，MgSO?改善；旷场测试中，手术减少总移动距离和中央区进入次数，MgSO?部分恢复。在MgSO?减轻LPS诱导的BV2小胶质细胞炎症激活和线粒体应激相关改变方面，LPS处理使CD206和Bcl-2降低，CD68、Iba1和Bax升高，MgSO?部分逆转；LPS显著降低p-AMPK，MgSO?恢复。剂量反应实验中，LPS增加TNF-α、IL-1β和IL-6，MgSO?（5、10、20 mM）呈浓度依赖性减轻这些炎症反应。TUNEL分析显示LPS刺激后TUNEL阳性细胞显著增加，MgSO?剂量依赖性减少；LPS降低相对ATP水平和线粒体膜电位，MgSO?部分改善。CD11b阳性海马小胶质细胞分选后分析显示，手术显著降低p-AMPK、PINK1和Parkin水平并增加p62，MgSO?部分恢复。在Compound C部分减弱MgSO?对LPS处理的BV2小胶质细胞的保护作用方面，LPS降低CD206并增加CD68和Iba1，MgSO?部分恢复正常，Compound C减弱了MgSO?的效应；MgSO?减轻LPS相关的TNF-α、IL-1β和IL-6升高，Compound C部分减弱该抗炎作用；MgSO?恢复LPS刺激后的相对ATP水平，Compound C存在时恢复作用减弱。总AMPK表达在各组间相对稳定，而LPS降低p-AMPK、PINK1和Parkin，MgSO?恢复这些蛋白，Compound C部分减弱MgSO?相关的恢复；LPS还降低TOMM20并增加DRP1，MgSO?部分恢复正常，Compound C减弱这些效应。在Compound C部分减弱MgSO?对术后小鼠的神经保护作用方面，手术增加海马TNF-α、IL-1β和IL-6，MgSO?显著降低这些炎症反应，Compound C部分减弱MgSO?的抗炎作用；手术降低CD206并增加CD68和Iba1，MgSO?部分恢复正常，Compound C减弱该效应。总AMPK表达变化不大，而手术降低p-AMPK、PINK1和Parkin，MgSO?恢复这些信号蛋白，Compound C部分减弱恢复。行为学方面，手术增加Morris水迷宫逃避潜伏期和错误次数，MgSO?改善，Compound C减少改善幅度；手术减少新物体探索时间和辨别率，MgSO?改善，Compound C部分减弱；旷场测试中MgSO?部分恢复手术相关的总移动距离和中央区进入次数减少，Compound C减弱该改善。

讨论部分指出，该研究表明MgSO?改善实验性POCD中的术后认知缺陷、海马神经炎症和线粒体质量控制异常。由于Morris水迷宫训练在术后早期开始，残余术后疼痛和手术相关运动障碍可能影响行为表现，但围术期镇痛、旷场测试和游泳速度分析提示游泳能力差异不太可能是逃避潜伏期差异的主要原因。手术与炎症细胞因子增加、小胶质细胞活化标志物改变、线粒体动力学相关蛋白改变、ATP水平降低、p-AMPK降低、PINK1/Parkin和LC3-II降低以及p62积累相关，MgSO?部分逆转这些改变并改善行为结局。LPS处理的BV2小胶质细胞中重复了类似效应，MgSO?改善ATP水平和线粒体膜电位并恢复PINK1/Parkin相关线粒体自噬蛋白谱。Compound C部分减弱MgSO?的分子、炎症、代谢和行为效应，支持AMPK信号参与该保护反应。开放胫骨骨折联合异氟烷麻醉广泛用于模拟围术期认知障碍及相关神经炎症。围术期镁稳态与认知结局相关，低镁血症在住院和老年人群中常见。镁可调节N-甲基-D-天冬氨酸受体活性、钙内流、氧化应激和炎症信号。线粒体功能障碍日益被认为是POCD中神经炎症与认知障碍之间的重要联系。PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬可限制受损线粒体积累并抑制炎症信号。由于该研究评估了线粒体自噬相关蛋白表达而非直接测量自噬流，结果被解释为恢复PINK1/Parkin相关线粒体质量控制谱，而非线粒体自噬通量增加的确凿证据。AMPK是中枢代谢传感器，可与线粒体质量控制通路相互作用。MgSO?恢复海马组织和BV2细胞中AMPK磷酸化，而Compound C部分减弱MgSO?对PINK1/Parkin信号、线粒体标志物、ATP水平、炎症反应和行为的影响，支持AMPK激活参与MgSO?神经保护作用并与PINK1/Parkin相关线粒体质量控制恢复功能相关。研究局限性包括：AMPK参与仅通过Compound C药理学评估，未使用遗传学方法；BV2细胞为永生化小胶质细胞模型，可能不能完全再现原代小胶质细胞表型；仅使用雄性小鼠和年轻成年动物，限制了年龄和性别依赖性反应的评估；ATP测量和JC-1染色不直接评估线粒体呼吸能力或氧化磷酸化效率；未测量自噬流；残余疼痛、炎症或运动障碍不能完全排除；研究主要关注术后早期变化，未系统评估长期认知结局或神经可塑性。结论：MgSO?减轻了实验性POCD中的神经炎症和认知功能障碍，同时改善海马线粒体质量控制异常和小胶质细胞活化相关标志物改变。在术后小鼠和LPS处理的BV2小胶质细胞中，疾病相关应激降低p-AMPK、PINK1、Parkin和LC3-II并增加p62；MgSO?部分逆转这些改变，恢复ATP相关读数，并改善线粒体应激相关改变。Compound C处理后这些效应部分丧失，支持AMPK信号参与MgSO?反应。综上，这些发现支持AMPK/PINK1/Parkin相关线粒体质量控制参与MgSO?在实验性POCD中的神经保护作用，并值得进一步机制和转化研究。