《Small》：High-Throughput FRET Affinity Screening Technique (HTFAST) for Cell-Free Expressed Binding Protein Characterization
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结合蛋白的快速工程化日益依赖无细胞、机器学习引导的优化策略，然而高通量、定量化的结合亲和力表征仍是主要瓶颈，尤其针对在无细胞体系中表达且未经纯化的蛋白。研究人员提出了高通量FRET亲和力筛选技术（High-Throughput FRET Affinity Sc
结合蛋白的快速工程化日益依赖无细胞、机器学习引导的优化策略，然而高通量、定量化的结合亲和力表征仍是主要瓶颈，尤其针对在无细胞体系中表达且未经纯化的蛋白。研究人员提出了高通量FRET亲和力筛选技术（High-Throughput FRET Affinity Screening Technique，HTFAST），用于对粗制大肠杆菌无细胞蛋白表达反应中直接表达的绑定蛋白进行快速亲和力表征。HTFAST利用无细胞表达的荧光蛋白融合绑定蛋白与染料标记抗原之间的F?rster共振能量转移（FRET），实现对平衡解离常数（equilibrium dissociation constant，KD）的实时、定量测量。研究人员基于SpyTag003–SpyCatcher003模型系统系统性优化了荧光团组合与标记参数。HTFAST可在粗制裂解液中可靠量化SpyTag003–SpyCatcher003的纳摩尔级亲和力，并可解析针对CD4、HER2与人血清白蛋白（HSA）等多种抗原纳米抗体的低纳摩尔至数百纳摩尔亲和力。进一步以一组五种SARS-COV-2受体结合域（RBD）纳米抗体进行基准测试，证明HTFAST对同靶标绑定蛋白的排序能力与报道的BLI/SPR测量值高度相关。最后研究人员证明双结合元件均可直接在CFE中表达，从而进一步简化筛选流程。综上，HTFAST提供了一种可扩展、定量且与无细胞体系兼容的高通量亲和力筛选方案，适用于DBTL蛋白工程循环。
研究背景与问题提出
在蛋白药物与结合蛋白开发过程中，纳米抗体（单域抗体，VHH）因分子量小、稳定性高、组织穿透性强，成为传统抗体的重要替代平台。设计-构建-测试-学习（DBTL）循环依赖机器学习引导的定向进化，但关键瓶颈在于：如何在无细胞蛋白表达（CFE）粗裂解液中，对成千上万候选分子进行定量、高通量亲和力测定。现有方法存在明显局限：酶联免疫吸附（ELISA）仅提供半定量EC50且需多步洗涤；表面等离子共振（SPR）与生物膜干涉（BLI）虽可获Kon、Koff与KD，但通量低、对粗体系背景敏感，通常要求纯化样品；AlphaLISA/AlphaScreen虽兼容粗样，但试剂昂贵、仅终点读取、无实时动力学信息。因此，亟需一种均相、免洗、免纯化、可实时定量且适配384孔板自动化的亲和力筛查技术。
研究人员开展的工作与核心结论
研究人员开发了HTFAST平台：将绑定蛋白以mScarlet3红色荧光蛋白（供体）融合，在CFE粗反应液中直接表达；抗原以NHS酯共价偶联Alexa Fluor 647（AF647，受体）染料标记。结合发生时，供体发射与受体激发光谱重叠，产生FRET。通过二维浓度滴定矩阵与受体发射或供体淬灭信号，配合二次结合模型拟合，直接得到表观KD。该技术无需纯化、无需洗涤、可在粗制大肠杆菌裂解液中运行，单日可筛查数百变异体，适合机器学习反馈循环。论文发表于《Small》。
主要关键技术方法
研究以SpyTag003–SpyCatcher003为模型系统筛选荧光对；采用NHS酯染料标记商品化抗原（人CD4、HER2、HSA及SARS-CoV-2 Spike RBD来自KACTUS COV-VM2BD）；构建mScarlet3融合纳米抗体在CFE中表达；利用384孔板二维滴定，采集供体/受体多通道荧光并做内滤效应校正；以二次1:1结合模型拟合KD；以Octet BLItz对SARS RBD纳米抗体做比对；以AlphaFold3预测供体色基与抗原赖氨酸空间距离分布，用FPbase计算F?rster半径R0。样本队列包含模型亲和对及已报道亲和力的CD4/Nb457、HER2/2Rs15d、HSA/Nb.b201与5株RBD纳米抗体（4D8、3F11、5F8、1E2、2F2）。
研究结果
3.1 荧光团筛选与标记度优化
以SpyTag003–SpyCatcher003系统比较TagRFP、SuperTagRFP、mKate2与mScarlet3，研究人员发现mScarlet3量子产率高、与AF647光谱重叠最佳，FRET效率最高（约53%，优化标记度后达70%）。标记度（DOL）研究表明DOL≈1.6时信号最强；不同DOL下拟合KD稳定在2.82–3.43 nM，与停流FRET文献值~3 nM一致，说明DOL主要影响信号幅度而不改变亲和力读取。
3.2 粗裂解液中的动力学与亲和力分析
分别用受体发射法与供体淬灭法拟合。纯化样品KD为3.2±0.3 nM；粗裂解液中供体淬灭法得3.5±1.4 nM、受体发射法4.5±1.4 nM，无统计差异。对CD4纳米抗体Nb457，供体淬灭法得3.9±0.6 nM，处于文献双价格式报道区间；HER2纳米抗体2Rs15d得5.40±1.31 nM（文献SPR 3.9 nM）；HSA纳米抗体Nb.b201得184±28 nM（文献430 nM，同属百纳摩尔级）。结果表明供体淬灭在粗样中更稳健，免除了供体渗漏与直接激发校正。
3.3 纳米抗体库筛查与基准测试
对5株SARS-CoV-2 RBD纳米抗体，HTFAST供体淬灭法与文献SPR高度相关（Pearson r=0.993，R2=0.985），优于BLI（r=0.937）。HTFAST正确识别最高亲和5F8（~1 nM）与最低亲和1E2（~35 nM），且能区分3.35–6.03 nM聚集区间的三株差异；BLI在此区间失效。结构分析显示多数抗原赖氨酸至mScarlet3色基距离小于R0（77.37 ?），支持有效能量转移；弱结合者HTFAST倾向低估KD，与HSA结果一致。
3.4 双元件无细胞共表达
研究人员进一步将SpyTag003与SpyCatcher003分别融合mScarlet3/mCitrine，在CFE双侧表达，受体发射法得表观KD 4.9±1.3 nM。但对较大复合体（Nb6101–BCL11A ZF456）FRET信号弱，提示当双方均为大蛋白融合荧光蛋白时，色基距离可能超出有效FRET范围；至少一端使用小分子染料（如AF647）对大结合对更必要。
讨论与结论翻译
讨论指出，HTFAST定位为定量初筛平台：在粗无细胞裂解液中以均相、免洗方式提供KD排序，后续可用SPR/BLI补测速率常数。FRET距离依赖性决定其最适配紧凑结合蛋白（纳米抗体、亲和标签），拓展至全长抗体需重设计荧光放置策略。
结论：研究人员建立并优化了HTFAST，以mScarlet3供体与AF647抗原受体实现免纯化CFE亲和力定量；供体淬灭法在粗裂解液中重复性与鲁棒性最佳；技术跨CD4、HER2、HSA与SARS-CoV-2 RBD验证，与SPR基准一致，并能解析同靶标细微亲和差异。该平台可嵌入无细胞DBTL循环，凭借自动化兼容与高通量特性，加速下一代结合蛋白的发现与机器学习引导优化。
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