《RSC Pharmaceutics》：Zein-hybrid invasomal sponges as a platform for drug repurposing from migraine to cancer treatment: formulation, optimization, in vitro and in vivo studiesOpen Access
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背景：结直肠癌（colorectal carcinoma，CRC）作为一种常见的胃肠道恶性肿瘤，由于现有治疗方案的毒性及成本效益不佳，治疗选择仍然有限。佐米曲普坦（Zolmitriptan，Zol）近期被发现在传统抗偏头痛作用之外还具有抗肿瘤活性。靶向程序性细
背景：结直肠癌（colorectal carcinoma，CRC）作为一种常见的胃肠道恶性肿瘤，由于现有治疗方案的毒性及成本效益不佳，治疗选择仍然有限。佐米曲普坦（Zolmitriptan，Zol）近期被发现在传统抗偏头痛作用之外还具有抗肿瘤活性。靶向程序性细胞死亡通路是抑制CRC进展的有效策略，而天然聚合物玉米醇溶蛋白（zein）可通过调节药物外排、克服多药耐药来进一步增强治疗效果。目的：本研究开发了一种zein杂合侵袭体纳米海绵系统，用于递送Zol作为CRC的新型治疗平台，旨在通过激活细胞凋亡（apoptosis）和铁死亡（ferroptosis）通路诱导肿瘤抑制。方法：采用薄膜水化法制备载Zol侵袭体（invasomes，INVs），并通过32全因子设计进行优化，以包封率（entrapment efficiency，EE%）、粒径（particle size，PS）、多分散指数（polydispersity index，PDI）和zeta电位（zeta potential，ZP）作为响应指标进行评价。随后将zein掺入选定的INVs中以增强囊泡特性和抗癌功效；之后将该制剂以纳米海绵形式进行体内评价。综合表征涵盖形态学评估、体外释放行为及短期储存稳定性。结果：最终zein杂合制剂表现出EE%为95.33 ± 0.58%，PS为588.47 ± 28.47 nm，PDI为0.69 ± 0.133，ZP为?38.50 ± 1.87 mV。zein杂合INV纳米海绵通过双重调节PTEN/PI3K/p-AKT/FOXO1/BAX/Bcl-2/PCNA凋亡轴和p53/SLC7A11/GPX4/MDA介导的铁死亡通路，诱导针对CRC的多重细胞死亡机制，组织病理学和免疫组织化学分析证实了上述结果。结论：优化的zein杂合INV纳米海绵代表了一种新型的双重作用CRC治疗策略，通过同时诱导细胞凋亡和铁死亡发挥作用。
一、研究背景与科学问题
结直肠癌（colorectal carcinoma，CRC）是全球范围内最常见的胃肠道恶性肿瘤之一，在女性恶性肿瘤中发病率位居第二，在男性中位居第三。据预测，到2040年全球癌症死亡人数将达到1640万，而2018年这一数字约为960万。目前CRC的标准治疗以手术切除为首选，术后根据分期和患者特征辅以化疗。已获批的化疗方案包括5-氟尿嘧啶（5-FU）、卡培他滨、伊立替康、奥沙利铂、三氟胸苷和替匹嘧啶等药物的组合。然而，现有方案在CRC的某些阶段缺乏成本效益，且伴随严重的不可耐受毒性和生活质量下降。化疗药物会破坏骨髓和毛囊等快速分裂的正常细胞，引起恶心、呕吐、黏膜炎、手足皮疹等副作用，严重时甚至可能致命。
在CRC的发病机制中，异常隐窝灶（aberrant crypt foci，ACF）被认为是最终进展为息肉和恶性肿瘤的早期前体。约三分之一的CRC病例中，这些发育异常改变由磷脂酰肌醇3-激酶催化亚单位α（PI3KCA）基因的错义突变与磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/AKT/mTOR）信号通路的激活共同引起。此外，p53突变通过磷酸化叉头框蛋白O（FOXO）阻碍细胞DNA修复和细胞凋亡。释放的AKT还可促进核因子-κB（NF-κB）和活化T细胞核因子（NFAT）的磷酸化，二者相互作用增强癌细胞增殖、血管生成和转移。
程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）是一种受严格调控、依赖能量的机制，涉及细胞凋亡、焦亡、坏死性凋亡、自噬和铁死亡等多种机制上截然不同的通路。PCD在维持正常组织稳态中发挥重要作用，CRC的发生和进展与PCD失调密切相关，整合和调节PCD机制是改善CRC患者预后的有前景的策略。铁死亡是一种2012年发现的调节性细胞死亡形式，其特征是多不饱和脂肪酸（PUFA）氧化、铁依赖性和脂质过氧化物修复缺陷。CRC表现出铁死亡抵抗，这种抵抗源于腺瘤性息肉病（APC）基因失活——该突变存在于80%的散发性CRC中——以及致癌基因激活。因此，动员铁死亡被认为是CRC治疗的合适靶点。
药物重定位策略在多个医学领域显示出前景，可让患者更快获得药物，同时降低漫长而艰难的药物开发过程中的费用。佐米曲普坦（Zolmitriptan，Zol）是一种曲普坦类药物，自1997年获批用于治疗偏头痛急性发作，通过激活血清素（5-HT）1B/1D受体亚型发挥作用。有研究表明Zol通过P物质释放调节细胞增殖、血管生成和转移。在肝细胞癌（HCC）模型中，Zol抑制了谷胱甘肽（GSH）/谷胱甘肽二硫化物（GSSG）比值，提示氧化应激增加促进细胞凋亡，并通过促凋亡蛋白BCL2相关X蛋白（BAX）和BCL2相关细胞死亡激动剂（BAD）的升高得到证实。然而，Zol在其他癌症特别是CRC中的抗肿瘤作用研究尚缺乏。
纳米颗粒制剂通过巨大的表面积和较小的粒径产生增强渗透和滞留效应，可实现更好的癌症治疗生物利用度。侵袭体（invasomes，INVs）是由脂质体衍生的超变形囊泡，萜烯嵌入磷脂双层中。天然萜烯能够提供和改善靶向癌细胞递送特性。玉米醇溶蛋白（zein）是一种来源于玉米的天然蛋白质聚合物，已被FDA认定为安全且有吸引力的生物医学材料。zein纳米颗粒因其显著的稳定性、生物相容性和储存亲水性或疏水性药物的能力而备受关注，且具有可生物降解性和延迟降解速率，适合作为控释药物载体。此外，zein可以影响癌细胞中药物外排泵的效率，降低多药耐药程度。纳米海绵是一种由聚合物构成的3D网络超交联结构，具有小尺寸、生物利用度、生物降解性和稳定性等优势。
据研究人员所知，这是首次研究负载Zol的zein杂合INVs用于CRC治疗。本研究旨在制备zein杂合INV纳米海绵，以充分利用Zol、萜烯和zein的三重作用增强CRC抗癌活性。
二、研究设计与主要技术方法
研究人员采用薄膜水化技术制备载Zol侵袭体，通过32全因子设计优化制剂配方，以包封率（EE%）、粒径（PS）、多分散指数（PDI）和zeta电位（ZP）为响应指标。将zein掺入选定的最优INV配方获得zein杂合制剂。通过透射电子显微镜（TEM）评估形态，傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析分子间相互作用，进行体外释放研究和3个月短期稳定性考察。采用冻干法制备纳米海绵，通过扫描电子显微镜（SEM）观察表面形态。体内研究采用30只成年雄性Wistar白化大鼠，使用1,2-二甲基肼（DMH）诱导CRC模型，分为正常对照组、DMH组、空白zein杂合INV组、游离Zol组和Zol负载zein杂合INV纳米海绵组，通过ELISA、qRT-PCR、组织病理学和免疫组织化学等方法评估抗肿瘤效果。
三、研究结果
3.1 制剂表征与优化
EE%范围为58.16 ± 0.23%至94.20 ± 0.28%，萜烯类型和用量均显著影响EE%。丁香酚（eugenol）因其亲水性（log P = 2.2）与亲水性药物Zol匹配，产生最高EE%，其次为柠檬醛和柠檬烯。增加萜烯用量导致EE%下降，可能归因于药物与萜烯在囊泡内的竞争以及膜流动性增强导致的药物泄漏。PS范围为246.50 ± 0.71 nm至558.60 ± 0.56 nm，亲水性丁香酚产生最大粒径，亲脂性柠檬烯产生最小粒径，增加萜烯用量增加粒径。PDI值均低于0.7，表明粒径分布较窄。所有制剂ZP均为负值（?24.00至?28.35 mV），丁香酚因酚羟基的存在产生最高ZP值。通过数值优化获得最优配方（Zol-INV1），由10 mg Zol、100 mg磷脂和10 mg丁香酚组成，期望值0.972，EE%为94.20 ± 0.28%，PS为246.50 ± 0.71 nm，PDI为0.43 ± 0.043，ZP为?28.35 ± 0.49 mV。
3.2 zein杂合制剂表征
zein杂合后EE%提高至95.33 ± 0.58%，PS增大至588.47 ± 28.47 nm，PDI为0.69 ± 0.133，ZP为?38.50 ± 1.87 mV。体外释放研究表明，zein杂合INVs在首小时出现22.00 ± 0.78%的初始突释，随后释放速率显著降低，6小时累积释放为52 ± 0.78%，显著低于Zol溶液的71 ± 1.84%，表明制剂具有持续释放特性。TEM显示囊泡结构尺寸约490–518 nm。FTIR分析表明zein的酰胺I带从1649.6 cm?1移至1643.9 cm?1，提示分子间氢键和疏水相互作用，未形成新的共价化合物。3个月储存后PS、PDI、ZP和EE%均无显著变化，证明制剂物理稳定性良好。纳米海绵药物含量为98 ± 0.8%至101 ± 1.1%，SEM显示高度多孔结构，未见Zol晶体，表明药物以无定形状态存在。
3.3 体内药效评价
组织病理学检查显示，DMH组和空白zein杂合INV组出现黏膜正常排列丧失、宽腔隐窝、异型增生细胞、核深染、有丝分裂象、充血血管和炎症细胞浸润。游离Zol组显示黏膜完整、隐窝规则排列，但固有层仍有轻度炎症浸润。zein杂合INV纳米海绵组接近正常，黏膜完整、隐窝规则排列，炎症浸润极轻微。组织学评分显示，zein杂合INV纳米海绵在所有五项组织病理学标准（隐窝扭曲、上皮异型增生、杯状细胞耗竭、黏膜增生和炎症细胞浸润）上均显著减轻病变严重程度。
3.4 分子机制研究
zein杂合INV纳米海绵通过双重调节PTEN/PI3K/p-AKT/FOXO1/BAX/Bcl-2/PCNA凋亡轴和p53/SLC7A11/GPX4/MDA介导的铁死亡通路，诱导CRC细胞凋亡和铁死亡。氧化应激标志物检测显示MDA和GSH水平发生相应变化。ELISA和qRT-PCR分析证实了PTEN、PI3K、p-AKT、NF-κB p65、SLC7A11、GPX4以及FOXO-1、NFAT、PCNA、P53、Bax和Bcl-2基因表达的改变。免疫组织化学检测细胞角蛋白20（CK20）的表达变化进一步支持了治疗效果。
四、结论
优化的zein杂合INV纳米海绵代表了一种新型的双重作用CRC治疗策略，通过同时诱导细胞凋亡和铁死亡发挥作用。该制剂具有良好的包封效率、持续释放特性、物理稳定性和显著优于游离药物的体内抗肿瘤效果，为CRC治疗提供了一种有前景的药物重定位纳米递送平台。
