《Advanced Science》：CircFAM65A/CANX Condensates Sequester FAM134B to Inhibit ER-phagy and Suppress Hepatocellular Carcinoma Progression
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内质网自噬（ER-phagy）已被认为与肿瘤进展相关，然而其在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）中的调控机制仍 largely 未被探索。本研究中，研究人员鉴定出 circFAM65A 为一种在 HCC 中表达下调的新型环状
内质网自噬（ER-phagy）已被认为与肿瘤进展相关，然而其在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）中的调控机制仍 largely 未被探索。本研究中，研究人员鉴定出 circFAM65A 为一种在 HCC 中表达下调的新型环状RNA（circRNA），其过表达可抑制 HCC 进展。机制上，circFAM65A 与 CANX 相互作用，并减弱 CANX 介导的 ER-phagy 促进及 HCC 进展。具体而言，circFAM65A 促进 CANX 凝聚体（condensate）形成，这些凝聚体 sequester FAM134B，减少 FAM134B-LC3 相互作用并抑制 ER-phagy。此外，研究人员设计了一种仿生膜包被纳米颗粒（PLGA/circFAM65A@M-3E11）递送 circFAM65A，该纳米颗粒在体内有效抑制 HCC 生长。综上，这些发现将 circFAM65A 鉴定为 CANX 介导 ER-phagy 的调控因子，并支持其递送作为 HCC 的潜在治疗策略。
论文解读
一、研究背景与问题
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是全球癌症相关死亡的第三大原因，且发病率仍在上升。尽管手术、局部区域治疗和系统治疗的进展改善了患者结局，但总体预后仍较差，主要原因是多数患者确诊时已处于晚期或转移阶段。因此，深入探究HCC进展的分子机制对于开发新型治疗策略至关重要。
自噬是一种溶酶体介导的降解过程，在应对营养缺乏和各种应激条件时维持细胞稳态中发挥关键作用。内质网自噬（ER-phagy）是由营养饥饿或未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR）诱导的选择性自噬形式。已有充分证据表明ER-phagy在肿瘤细胞中发挥保护作用，肿瘤细胞通过上调自噬选择性降解受损细胞器和错误折叠蛋白，从而回收大分子和氨基酸以支持生物合成代谢和能量产生。然而，自噬在HCC中的关键调控分子和机制仍知之甚少。
液-液相分离（liquid-liquid phase separation, LLPS）是一种生物物理过程，某些蛋白质和核酸通过该过程凝聚成液态、无膜细胞器，为细胞内多种生物活性的时空控制提供通用机制。LLPS失调已被认为是肿瘤发生的关键驱动因素，且LLPS广泛参与自噬调控，包括自噬体起始与形成、底物识别与募集以及自噬相关基因的转录调控。目前关于circRNA驱动的LLPS在HCC中的研究仍有限，circRNA如何调控肿瘤相关LLPS动态组装进而驱动肿瘤进展的机制有待进一步阐明。
环状RNA（circular RNAs, circRNAs）已被证明通过多种机制发挥促肿瘤或抑肿瘤功能，包括miRNA海绵吸附、蛋白支架和翻译模板等。除经典功能外，一些circRNA通过调控蛋白质LLPS影响肿瘤进展。本研究在此背景下，探索circFAM65A在HCC中的作用及其通过调控CANX相分离影响ER-phagy的新机制。
二、研究内容与主要结论
研究人员首先通过分析circRNA微阵列数据集（GSE97332），鉴定出在HCC中显著下调的circRNA（hsa_circ_0000708），命名为circFAM65A。circFAM65A来源于FAM65A基因的内含子1，具有闭环结构，在HCC组织和细胞系中表达下调，且对RNase R和放线菌素D处理具有抗性。功能实验表明，circFAM65A过表达显著抑制HCC细胞增殖和迁移，其敲低则促进这些过程；体内实验也证实circFAM65A过表达显著抑制裸鼠皮下移植瘤生长。
机制研究方面，研究人员采用HyPro-MS邻近标记蛋白质组学方法，鉴定出116个circFAM65A特异性互作蛋白，其中CANX（calnexin，内质网钙结合蛋白家族成员）显著富集。CANX含有内在无序区域（intrinsically disordered regions, IDRs），具备发生LLPS的结构特征。通过RNA pull-down、RIP、免疫荧光及活细胞成像等实验，研究人员证实circFAM65A与CANX直接结合并在细胞质中共定位形成凝聚体；CANX的P结构域介导二者结合，删除P结构域显著损害circFAM65A/CANX凝聚体的形成。
进一步研究发现，CANX在HCC中高表达，且高表达CANX的患者预后较差。CANX过表达促进HCC细胞增殖、迁移和自噬通量，尤其是促进ER-phagy，并抑制凋亡；CANX敲低则产生相反效果。体内实验证实CANX敲低抑制肿瘤生长。这些结果表明CANX促进ER-phagy和HCC进展。
鉴于CANX含IDR，研究人员验证了其相分离倾向。CANX在细胞内和体外均可形成具有液态特征的液滴，FRAP实验证实其高动态性。CANX的IDR2（524-592 aa）是凝聚体形成的关键区域。circFAM65A过表达不改变CANX蛋白水平，但显著增加CANX凝聚体的数量和大小。体外实验显示，circFAM65A和HCC细胞总RNA可促进CANX液滴形成，而tRNA无此效果；RNase A处理消除该效应，RNase R则无影响。这些结果表明circFAM65A增强CANX凝聚体形成。
在功能层面，circFAM65A过表达抑制自噬和ER-phagy，促进HCC细胞凋亡。挽救实验表明，circFAM65A与CANX全长（CANXFL）共表达可逆转CANX促进的ER-phagy、细胞增殖、迁移和抗凋亡效应，而与CANXΔP或CANXΔIDR2共表达则无此效果。体内实验同样确认circFAM65A可逆转CANX促进的肿瘤生长。
关于凝聚体调控ER-phagy的分子机制，研究人员发现FAM134B是CANX的互作蛋白，且FAM134B是已知的ER-phagy受体。circFAM65A不显著影响CANX-FAM134B结合，但circFAM65A存在时，FAM134B被募集到circFAM65A/CANX凝聚体中；单独CANX不能募集FAM134B。CANX的跨膜（TM）结构域和IDR2对FAM134B的募集至关重要。功能实验表明，circFAM65A/CANX共表达阻断FAM134B诱导的ER-phagy，而CANXΔTM或CANXΔIDR2不能实现该阻断。重要的是，circFAM65A/CANX共表达显著减少FAM134B与LC3的相互作用，而CANXΔTM或CANXΔIDR2共表达则无此效应。免疫荧光实验也证实circFAM65A/CANX共表达破坏FAM134B与LC3的共定位，并增加FAM134B的凝聚体形成。因此，circFAM65A通过促进CANX凝聚体形成并 sequester FAM134B，减少FAM134B与LC3的相互作用，从而抑制ER-phagy。
基于上述机制，研究人员开发了仿生膜包被纳米颗粒递送系统（PLGA/circFAM65A@M-3E11），由负载circFAM65A的PLGA纳米颗粒包被表达抗GPC3单链抗体（scFv）的巨噬细胞膜组成。该纳米颗粒在体外能有效靶向并进入HCC细胞，在体内皮下移植瘤模型中显著富集于肿瘤组织。PLGA/circFAM65A@M-3E11治疗显著抑制肿瘤体积和重量，降低增殖标志物Ki-67表达，增加凋亡标志物cleaved caspase3水平，且未引起明显的全身毒性或主要脏器病理变化。
三、关键技术与方法
本研究采用的主要技术方法包括：circRNA微阵列数据分析（GSE97332数据集）；RT-qPCR、FISH、RNase R和放线菌素D处理验证circRNA表达和稳定性；HyPro-MS邻近标记蛋白质组学鉴定circRNA互作蛋白；circRNA-TurboID邻近标记系统验证互作；RNA pull-down和RIP实验；免疫荧光和活细胞成像；TCGA数据库和单细胞测序数据分析；自噬通量检测（RFP-GFP-LC3、RFP-GFP-KDEL、mCherry-Sec61B报告系统）；透射电镜（TEM）观察自噬体；重组蛋白表达纯化与体外相分离实验；FRAP实验；Co-IP；RNA-seq；仿生纳米颗粒制备（PLGA/circFAM65A@M-3E11）及其表征（SEM、TEM、动态光散射）；体内肿瘤模型和器官毒性评估。临床样本来自西京医院（中国西安）的12对HCC及癌旁新鲜组织。
四、研究结果总结
2.1 circFAM65A在HCC中下调，其过表达在体外和体内抑制HCC进展：通过circRNA微阵列分析鉴定出circFAM65A（hsa_circ_0000708），经Sanger测序和RT-PCR验证其闭环结构；在HCC组织和细胞系中表达下调；过表达circFAM65A抑制HCC细胞增殖和迁移，敲低则相反；体内实验证实circFAM65A过表达抑制肿瘤生长。
2.2 circFAM65A与CANX在HCC细胞中结合并共聚集：HyPro-MS鉴定CANX为circFAM65A的互作蛋白；RIP和RNA pull-down验证二者结合；CANX含IDR结构；免疫荧光显示二者共定位于细胞质凝聚体；CANX的P结构域介导与circFAM65A的关联。
2.3 CANX在体外和体内促进ER-phagy和HCC进展：TCGA数据库和IHC显示CANX在HCC中高表达；CANX过表达促进增殖、迁移、自噬和ER-phagy，抑制凋亡；CANX敲低则相反；体内实验证实CANX敲低抑制肿瘤生长。
2.4 circFAM65A在HCC细胞和体外增强CANX凝聚体形成：CANX在细胞和体外形成液态凝聚体，依赖IDR2；circFAM65A过表达增加CANX凝聚体数量；circFAM65A和总RNA促进CANX体外液滴形成。
2.5 circFAM65A减弱CANX促进的ER-phagy和HCC进展：circFAM65A抑制自噬和ER-phagy，促进凋亡；与CANXFL共表达逆转CANX的促ER-phagy、增殖、迁移和抗凋亡效应，与CANXΔP或CANXΔIDR2共表达无效；体内实验同样验证。
2.6 circFAM65A/CANX凝聚体 sequester FAM134B并抑制ER-phagy：FAM134B被募集到circFAM65A/CANX凝聚体中，依赖CANX的TM和IDR2结构域；circFAM65A/CANX共表达阻断FAM134B诱导的ER-phagy，减少FAM134B-LC3相互作用，破坏二者共定位。
2.7 仿生膜包被纳米颗粒实现circFAM65A靶向递送并有效抑制HCC体内生长：PLGA/circFAM65A@M-3E11纳米颗粒靶向HCC细胞并在肿瘤中富集；治疗显著抑制肿瘤生长，增加凋亡，降低增殖，且无明显毒性。
五、讨论与结论
讨论部分指出，自噬在肿瘤起始阶段发挥抑癌作用，但在进展阶段支持肿瘤细胞存活和适应。circRNA与LLPS的相互作用是近年研究热点，本研究首次揭示circFAM65A通过促进CANX凝聚体形成来抑制ER-phagy和HCC进展的新机制。研究还发现，CANX的P结构域虽然介导与circFAM65A的关联，但该结构域位于内质网腔内，而circFAM65A主要存在于细胞质中，因此二者之间可能不是直接RNA-蛋白识别，而是通过构象变化或细胞质侧分子复合物介导。此外，体外纯化系统未使用去垢剂或膜重构，不能完全模拟天然膜环境，可能影响对凝聚体生物物理性质的判断。最后，体内疗效仅在皮下异种移植模型中验证，缺乏原位、免疫competent或患者来源模型，且未包含线性RNA对照，这些局限需要在未来研究解决。
研究结论部分：研究人员鉴定circFAM65A为在HCC中下调的抑癌circRNA。机制上，circFAM65A促进CANX凝聚体形成，这些凝聚体 sequester FAM134B，减少FAM134B-LC3相互作用，从而抑制ER-phagy和HCC进展。基于此，研究人员开发了PLGA/circFAM65A@M-3E11仿生纳米系统用于向HCC细胞递送circFAM65A，并证明其在体内的抗肿瘤疗效。该研究揭示了circFAM65A增强CANX凝聚与抑制ER-phagy和HCC进展之间的联系机制，支持circFAM65A递送作为HCC的潜在治疗策略。
（注：依据原文内容浓缩，未添加推测性信息，专业术语均保留原文大小写和上下角标。）
