皮肤-电极界面持续电刺激经L型CaV1.3电压门控钙通道增强Ca2+响应并促进创面修复

《Advanced Science》：Adaptive Cellular Responsiveness to Electrical Stimulation at the Skin-Electrode Interface

　　

可穿戴电刺激（electrical stimulation, ES）设备正成为创面愈合的新兴平台；皮肤-电极界面的细胞响应关键影响治疗结局。研究人员证明，皮肤细胞可通过上调电压门控钙通道（voltage-gated calcium channels, VGCCs）并增强其对电学线索的敏感性，动态适应持续ES。利用透明铟锡氧化物（indium tin oxide, ITO）基生物电子平台，研究人员发现ES诱导的L型VGCC Ca_V1.3上调可放大后续刺激期间的细胞内钙（Ca²⁺）内流。通过皮肤共形ITO基可穿戴设备递送的ES同样增加小鼠创面组织中Ca_V1.3表达，并伴随创面愈合加速、胶原沉积增强、血管重塑以及CD206/iNOS巨噬细胞相关标志物平衡变化。使用硝苯地平（nifedipine）对L型VGCC进行药理学抑制可抑制Ca_V1.3上调并减弱上述再生反应，支持VGCC介导的Ca²⁺信号对ES辅助创面修复的功能性贡献。人皮肤细胞在持续ES后进一步表现增强的Ca²⁺响应性以及协调的转录组和蛋白质组重塑。这些发现将适应性VGCC相关Ca²⁺信号鉴定为生物电子界面持续ES响应的关键细胞机制。

研究背景与问题：可穿戴电刺激（electrical stimulation, ES）设备通过向损伤皮肤递送局部电学线索促进创面愈合，其疗效与细胞增殖、迁移、血管生成和组织重塑相关。由于设备直接接触损伤组织，皮肤-电极界面成为电输入首先被接收并转化为生物响应的主要位点。皮肤细胞中的电压门控离子通道（voltage-gated ion channels, VGICs）可将胞外电学线索与胞内信号耦联，其中电压门控钙通道（voltage-gated calcium channels, VGCCs）直接调控Ca²⁺内流，而Ca²⁺信号控制增殖、存活、迁移及修复相关基因调控，并上游调节磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase, PI3K）-AKT-雷帕霉素机制靶点（mechanistic target of rapamycin, mTOR）、Raf-MEK-细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase, ERK）及糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β, GSK3β）相关信号。既往研究多关注ES下游事件，而非皮肤细胞如何适应持续ES；持续治疗中VGCC可用性、分布或功能特性是否动态重塑，以及Ca²⁺介导信号是否在皮肤-器件界面被更广泛重塑，仍不清楚。该研究发表于《Advanced Science》，旨在解析持续ES下皮肤细胞的适应性响应及其对创面修复的贡献。

关键技术与方法：研究采用透明ITO（indium tin oxide, ITO）薄膜电极构建细胞-电极界面，并以B16F10小鼠黑色素瘤细胞、人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVEC）、NIH3T3成纤维细胞和人表皮黑素细胞（human epidermal melanocytes, HEMa）为模型；B16F10和HUVEC购自ATCC，NIH3T3购自Korean Cell Line Bank，HEMa购自PromoCell。采用实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, RT-qPCR）、免疫细胞化学（immunocytochemistry, ICC）、Western blot和活细胞Ca²⁺成像（GCaMP6s或X-Rhod-1 AM）评估VGCC表达与Ca²⁺响应；用有限元分析（finite element analysis, FEA）计算电场（electric field, EF）并以示波器实测验证，建立C57BL/6J小鼠全层皮肤创面模型；用免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）、苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）染色、Masson三色（Masson’s trichrome, MT）染色和串联质量标签（tandem mass tag, TMT）定量蛋白质组学评估组织修复与分子重塑，并监测电流、pH及H₂O₂评估电化学稳定性。

主要研究结果：
2.1 ES诱导皮肤细胞VGCC表达和电响应性增强（ES-Induced Enhancement of VGCC Expression and Electrical Responsiveness in Skin Cells）：在ITO薄膜电极上以0.50 V刺激B16F10细胞24 h，该条件增强增殖且无明显细胞毒性；69基因RT-qPCR显示L型VGCC相关基因CACNA1D（Ca_V1.3）、CACNA1C（Ca_V1.2）和CACNA1E（Ca_V2.3）上调，其中CACNA1D最显著，电压门控Na⁺和K⁺通道基因变化较小；RAS、Raf、MEK、mTOR和β-catenin上调，凋亡相关基因无显著变化。ICC和Western blot证实ES增加Ca_V1.3蛋白表达，HUVEC和NIH3T3中Ca_V1.3荧光亦增加。GCaMP6s活细胞Ca²⁺成像显示，预暴露于ES的细胞在后续刺激中激活细胞比例显著高于未预刺激细胞，硝苯地平（nifedipine）降低该激活比例并减弱ES诱导的增殖。结论：持续ES诱导适应性VGCC上调并敏化皮肤相关细胞对后续ES的Ca²⁺响应。
2.2 ES适应性VGCC上调与体内创面闭合加速（ES-Adaptive VGCC Upregulation and Accelerated Wound Closure In Vivo）：FEA将体外0.50 V条件下细胞层EF（7.50–8.00 mV mm^?1）转化为体内5.00 V匹配条件，伤口边界表皮和真皮区域计算EF约7.00–7.50 mV mm^?1，实测体内和离体EF约9 mV mm^?1；采用5.00 V、2 h ES/1 h休息、7天方案，接触区温升低于1.5°C，电流、pH和H₂O₂保持稳定。小鼠6 mm全层创面中，ES组第7天创面组织Ca_V1.3表达较sham组增加37.1±8.40%，硝苯地平抑制该上调；ES加速创面闭合，第7天较sham组增加63.2±11.7%，并促进再上皮化和胶原沉积，硝苯地平减弱这些修复效应。结论：EF匹配的ES在体内诱导VGCC上调并促进创面修复。
2.3 ES诱导创面组织血管重塑和巨噬细胞相关标志物变化（ES-Induced Vascular Remodeling and Macrophage-Associated Marker Changes in Wound Tissue）：第7天创面组织IHC显示，ES组内皮细胞标志物CD31信号较sham组增加76.9±9.50%，血管计数约2.5倍，Ca_V1.3/CD31阳性面积增加47.7±5.51%，硝苯地平减弱这些变化；CD68总体强度组间无显著差异，但ES组CD68⁺CD206⁺比例较sham组增加35.7±6.34%，CD68⁺iNOS⁺比例降低58.4±1.35%，CD206⁺/iNOS⁺比值约3.3倍，硝苯地平抑制上述标志物变化。结论：ES伴随创面血管重塑及CD206/iNOS巨噬细胞相关标志物平衡改变，并依赖L型VGCC。
2.4 人皮肤细胞适应ES的转录组和蛋白质组分析（Transcriptional and Proteomic Analyses of Human Skin Cell Adaptation to ES）：HEMa细胞在0.50 V、48 h条件下增殖增强最明显；靶向基因分析显示VGCC及Ca²⁺下游信号相关基因上调，GSK3β表达降低；X-Rhod-1 AM活细胞Ca²⁺成像显示，预暴露ES的HEMa细胞后续响应比例高68.9±10.0%，硝苯地平减弱该响应并减弱ES诱导增殖；TMT定量蛋白质组学检测约3000个蛋白，75个蛋白显著变化，其中38个上调、1个下调，包括LRRC8C、NRAP、COA3和TMT1A；基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析显示核糖体生物发生、RNA代谢、翻译、线粒体活性、细胞骨架组织和黏着斑等过程显著富集。结论：人皮肤细胞在持续ES后发生VGCC相关转录和蛋白质组重塑，支持该适应性响应在物种间的相关性。

讨论与结论总结：该研究将适应性VGCC相关Ca²⁺信号置于皮肤-生物电子界面持续ES响应的核心，通过体外小鼠细胞、体内小鼠创面及人皮肤细胞模型，将VGCC上调与后续Ca²⁺响应敏化、创面闭合加速、胶原沉积、血管重塑和巨噬细胞相关标志物平衡变化相联系；硝苯地平对L型VGCC的药理学抑制减弱Ca_V1.3上调和再生反应，支持VGCC介导Ca²⁺信号的功能贡献。人皮肤细胞的转录组和蛋白质组数据进一步提示生物合成、代谢和结构重塑。持续VGCC调控的详细反馈机制尚待完全阐明。研究意义在于强调ES辅助创面愈合中适应性细胞响应的重要性，并提出以VGCC相关信号为中心开发自适应生物电子疗法的框架。

研究结论翻译：本工作确立，持续ES通过增强VGCC相关Ca²⁺响应动态重塑生物电子界面处皮肤细胞的功能状态。利用透明ITO基生物电子平台并结合转录组、蛋白质组、免疫学和活细胞Ca²⁺成像分析，研究人员在体外小鼠和人皮肤来源细胞模型中鉴定VGCC相关Ca²⁺敏化为该适应性ES响应状态的关键介质。研究人员进一步将上述发现扩展到小鼠创面组织，所用ES条件经FEA指导刺激、直接EF测量及电学和电化学稳定性评估实验验证。ES增加创面组织Ca_V1.3表达，并在基质和血管区域观察到Ca_V1.3信号增加，同时促进以创面闭合加速、胶原沉积、血管重塑和巨噬细胞相关标志物谱变化为特征的再生反应。重要的是，使用硝苯地平药理学抑制L型VGCC减弱这些ES诱导效应，进一步强调VGCC介导Ca²⁺信号对ES辅助组织修复的功能贡献。尽管持续VGCC调控的详细反馈机制尚待完全阐明，本研究为皮肤细胞如何适应生物电子界面持续电刺激提供了见解。总体而言，这些发现强调研究ES辅助创面愈合中适应性细胞响应的重要性，并提出以VGCC相关信号为中心开发自适应生物电子疗法的框架。