水稻OsDREB1B转录因子调控低温与盐胁迫应答的功能解析

《Plant Physiology and Biochemistry》：OsDREB1B regulates cold and salt stress responses in rice ( Oryza sativa L.)

　　

摘要专业翻译 水稻（Oryza sativa L.）持续暴露于包括低温、干旱和高盐在内的不利环境条件，这些条件严重制约其生长、产量和地理分布。为应对非生物胁迫，水稻进化出复杂的转录调控网络，其中脱水响应元件结合蛋白（DREB）转录因子是关键节点。本研究对15个水稻DREB蛋白进行了比较序列、结构和系统发育分析，并检测了相应基因在冷、盐和聚乙二醇（PEG）诱导渗透胁迫下的表达模式。基于其对低温和盐处理的快速转录响应，研究人员选择OsDREB1B进行深入功能表征。通过两个独立的CRISPR/Cas9基因敲除突变体的亚细胞定位和功能分析，研究人员探究了OsDREB1B在水稻非生物胁迫应答中的作用。结果表明，正常条件下OsDREB1B-GFP定位于细胞核和质膜，而低温处理（4°C）后其核积累显著增加。与野生型相比，osdreb1b突变体在低温和盐胁迫下表现出更严重的损伤表型、更高的活性氧（ROS）积累、丙二醛（MDA）含量和相对电导率（REC），以及更低的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性。此外，胁迫响应基因如OsCatB、OsRab16A、OsHKT1;5和OsNHX1在突变体中的诱导表达减弱。然而，在PEG诱导的渗透胁迫下未观察到显著表型差异。综上，本研究表明OsDREB1B通过维持氧化还原稳态正向调控水稻的低温与盐胁迫应答，为进一步理解DREB转录因子的功能特化提供了新见解。

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一、研究背景与科学问题

水稻作为全球重要的粮食作物，其生长发育和产量持续受到低温、干旱和盐碱等非生物胁迫的严重制约。为抵御这些逆境，植物演化出了精密的转录调控网络，其中脱水响应元件结合蛋白（DREB）转录因子家族扮演着核心角色。DREB蛋白属于APETALA2/乙烯应答因子（AP2/ERF）超家族，能够特异性结合下游胁迫响应基因启动子中的脱水响应元件/C重复序列（DRE/CRT，共有序列A/GCCGAC），从而激活一系列生理代谢适应机制，包括渗透调节、膜完整性维持和活性氧（ROS）清除。在拟南芥中，DREB1/CBF分支主要响应低温，而DREB2分支则主要被干旱和高盐诱导。然而，现有研究存在以下关键问题亟待解决：首先，水稻中单个DREB成员在不同胁迫（冷、旱、盐）下的功能特化程度、激活动力学和目标基因选择性尚不完全清楚；其次，DREB蛋白协调多种非生物胁迫应答的分子机制，特别是如何调控ROS清除、渗透保护物质积累和膜脂重塑，仍缺乏明确阐释；第三，DREB蛋白的亚细胞动态分布——包括胁迫诱导的核质穿梭、翻译后修饰依赖的定位变化及功能区室化——尚未得到充分研究，这限制了对空间调控如何微调其转录活性的理解。因此，本研究旨在系统鉴定水稻DREB家族成员，并深入解析特定成员OsDREB1B在非生物胁迫应答中的功能和机制。

二、研究内容与主要结论

研究人员通过对15个水稻DREB蛋白进行系统的比较基因组学和表达谱分析，筛选出受低温和盐胁迫快速诱导的候选基因OsDREB1B，进而利用CRISPR/Cas9技术创制了两个独立的功能缺失突变体（osdreb1b^CR1和osdreb1b^CR2），结合亚细胞定位观察和生理生化指标测定，揭示了OsDREB1B在冷、盐胁迫应答中的正调控作用。主要结论如下：（1）OsDREB1B的缺失导致水稻对低温和盐胁迫的敏感性显著增加，但对PEG模拟的渗透胁迫不敏感；（2）OsDREB1B通过维持ROS稳态来增强胁迫耐受性，其突变体中抗氧化酶活性降低、ROS过度积累、膜脂过氧化加剧；（3）OsDREB1B呈现独特的亚细胞分布模式，正常情况下分布于细胞核和质膜，低温处理后显著向细胞核富集。这一发现为理解DREB转录因子的功能特化和空间调控机制提供了新的视角，也为水稻抗逆遗传改良提供了潜在靶点。

三、关键技术方法

1. 1.
   生物信息学分析：对15个水稻DREB蛋白进行多序列比对、最大似然法系统发育树构建（含61个物种133条序列）、保守基序（MEME）和基因结构分析，以及顺式作用元件预测（PlantCARE）。
2. 2.
   基因编辑与突变体验证：采用CRISPR/Cas9技术在中花11号（ZH11）背景下创制OsDREB1B敲除突变体，经Sanger测序确认获得两个独立纯合等位基因系（4 bp缺失和1 bp插入），并通过潮霉素标记检测排除转基因残留。
3. 3.
   亚细胞定位分析：将OsDREB1B-GFP融合蛋白在本氏烟（Nicotiana benthamiana）叶片中瞬时共表达核标记（H2B-mCherry）或质膜标记（PAD62-mCherry），利用激光共聚焦显微镜观察常温与4°C处理后的荧光分布，并通过ImageJ定量核/总荧光比值。
4. 4.
   生理指标测定：测定存活率、相对电导率（REC）、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性，以及H₂O₂和O₂^•?含量，并结合二氨基联苯胺（DAB）和氮蓝四唑（NBT）组织化学染色评估ROS积累。

四、研究结果

3.1 水稻DREB蛋白家族的多序列比对与系统发育分析

对15个水稻DREB蛋白的分析表明，所有成员均含有一个保守的AP2 DNA结合域，且AP2结构域内存在保守的YRG、WLG和RAYD序列特征以及特征性的V14和E19残基。基于61个物种133条DREB蛋白序列的系统发育树将其分为四个主要类群（Group I-IV），单子叶和双子叶蛋白在各组中均有分布。OsDREB1B与其他单子叶植物的DREB1同源物聚类在一起，显示密切的亲缘关系。进一步对单子叶CBF/DREB蛋白的单独分析显示，它们主要分为两大类，其中13个成员（包括OsDREB1B）归为一类，而OsDREB2A和OsDREB2B归为另一类。

3.2 OsDREB的保守基序、结构域、基因结构与启动子顺式作用元件分析

在OsDREB家族中鉴定出10个不同的保守基序，除OsDREB1J和OsDREB6外，其余成员均含有基序1、2和3，且同一亚组内的基序组成和分布高度相似。基因结构分析显示所有蛋白均包含保守的AP2结构域。对起始密码子上游2 kb区域的顺式作用元件分析发现，广泛存在脱落酸（ABA）、吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、玉米素（ZT）、6-苄基腺嘌呤（6-BA）和水杨酸（SA）等激素响应元件，以及低温、干旱、光、昼夜节律、机械损伤和厌氧条件相关元件，其中光和MeJA响应元件尤为丰富。

3.3 水稻与其他植物间DREB的共线性分析

共线性分析显示，水稻OsDREB与拟南芥之间存在10个共线性基因对，而与玉米和小麦分别存在23和21个共线性基因对。这表明DREB转录因子家族在被子植物中经历了不同的进化过程，单子叶植物间的保守性高于单子叶与双子叶植物之间。

3.4 OsDREB参与非生物胁迫应答

通过qRT-PCR和半定量RT-PCR分析了15个OsDREB基因在冷（4°C）、盐（100 mM NaCl）和PEG（12.5% w/v PEG 6000）诱导渗透胁迫下的表达模式。结果显示，OsDREB2A在冷胁迫下下调，而大多数其他成员上调，反映了DREB1与DREB2亚组间的功能分化。盐胁迫下，OsDREB1B、OsDREB1C、OsDREB1D、OsDREB1E、OsDREB1F、OsDREB1G、OsDREB1H、OsDREB1J、OsDREB2A、OsAP211和OsDREB42显著上调，而OsDREB1A显著下调。PEG胁迫下，多数成员也显著上调。其中，OsDREB1B受三种胁迫均显著诱导，因此被选作后续功能研究的对象。

3.5 OsDREB1B的亚细胞定位

在本氏烟叶片中瞬时表达OsDREB1B-GFP融合蛋白，发现正常条件下GFP荧光同时定位于细胞核和质膜（与质膜标记PAD62-mCherry共定位）。经4°C处理24小时后，OsDREB1B-GFP荧光主要集中于细胞核，定量分析显示核/总GFP荧光比值显著升高，表明低温促进了OsDREB1B的核积累。

3.6 OsDREB1B缺失增加植株对非生物胁迫的敏感性

两个独立osdreb1b突变体在冷和盐胁迫处理3天并恢复7天后，表现出比野生型更严重的伤害症状和显著更低的存活率，且在盐胁迫下差异更为明显；但在PEG胁迫下无显著差异。生理指标测定显示，冷和盐胁迫下，突变体的SOD、CAT、POD活性均低于野生型，而MDA含量和REC则更高。H₂O₂和O₂^•?含量定量测定及DAB/NBT染色均一致表明突变体中ROS积累更多。此外，胁迫响应基因OsCatB、OsRab16A、OsHKT1;5和OsNHX1在突变体中的诱导表达水平低于野生型。这些结果表明，OsDREB1B缺失损害了抗氧化能力，促进了ROS积累和膜损伤。

五、讨论与结论总结

讨论部分：研究指出，尽管多个OsDREB成员在转录水平受胁迫诱导，但只有通过遗传学证据才能确定其功能必要性。本研究中两个独立突变体在冷和盐胁迫下表现出一致的敏感表型，为OsDREB1B参与这些胁迫应答提供了遗传支持，但未做互补实验是其局限性。在亚细胞定位方面，OsDREB1B呈现独特的核与质膜双定位模式，且低温促进其核积累，这与已报道的其他DREB成员主要为核定位不同，暗示可能存在环境信号调控的亚细胞分布变化机制。在生理机制上，OsDREB1B缺失导致抗氧化酶活性下降和ROS过度积累，证实其通过维持氧化还原稳态发挥功能。尽管OsDREB1B转录受PEG诱导，但突变体在该胁迫下无明显表型，说明转录诱导本身并不等同于功能必需性，可能由于其他DREB成员的功能冗余或补偿作用。

研究结论：本研究将OsDREB1B鉴定为水稻冷和盐胁迫应答的正调控因子。OsDREB1B的缺失会削弱抗氧化能力，增加氧化损伤，并降低植株在冷和盐胁迫下的存活率。相比之下，在本研究所用的PEG诱导渗透胁迫条件下，OsDREB1B的破坏并未产生明显的表型。值得注意的是，OsDREB1B-GFP在低温处理后显示出增加的核积累，但这种亚细胞分布变化的机制和功能意义仍有待确定。这些发现为OsDREB1B参与水稻冷和盐胁迫应答提供了遗传证据，并拓展了研究人员对水稻DREB转录因子在非生物胁迫应答中作用的认识。