鸽腺病毒1型快速现场检测胶体金免疫层析试纸条的研发与临床验证

《Poultry Science》：A Novel Immunochromatographic Strip for Rapid and Field-Deployable Detection of Pigeon Adenovirus Type 1

　　

鸽腺病毒1型（Pigeon Adenovirus Type 1, PiAdV-1）是幼鸽腹泻病的病原体，给全球养鸽业造成巨大经济损失。在养禽场进行快速检测有助于疾病控制。本研究利用pET-28a载体在原核表达系统中重组表达了PiAdV-1的Hexon和Fiber-2蛋白，并用于免疫BALB/c小鼠。通过传统杂交瘤融合技术成功筛选出两株分别靶向Hexon和Fiber-2蛋白的单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAbs）1H2和2F1。研究人员采用胶体金标记的1H2开发了一种免疫层析试纸条（immunochromatography test strip, ICS），用于PiAdV-1的快速检测。特性分析显示，该ICS具有优异的灵敏度和特异性，检测限为5.76×103 copies/μL，且与常见鸽病毒包括PiAdV-2、鸽副黏病毒、鸽圆环病毒和鸽轮状病毒均无交叉反应。此外，研究人员将该ICS与聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）对300份样本的检测结果进行了比较验证。ICS和PCR的诊断阳性率分别为22.67%（68/300）和25.33%（76/300）。在300份田间粪便样本中，ICS与PCR结果的符合率为97.34%。因此，该ICS将有助于临床粪便样本中PiAdV-1的快速有效检测。

论文解读

一、研究背景与意义

鸽腺病毒1型（PiAdV-1）属于腺病毒科（Adenoviridae）禽腺病毒属（Aviadenovirus），是一种无包膜、非节段性线性双链DNA病毒。PiAdV-1主要感染12月龄以下的幼鸽，其中3至5月龄发病率最高，典型临床症状包括呕吐、水样腹泻和体重减轻，对未接种疫苗的鸽群具有高度传染性和致死率。该病毒在中国及全球范围内广泛传播，给养鸽业造成严重经济损失。目前尚无有效的商业化疫苗或抗病毒药物可用于预防PiAdV-1感染，因此快速准确的诊断对于该病的防控至关重要。

当前PiAdV-1感染的诊断主要依赖实验室检测方法，包括常规PCR和实时荧光定量PCR。然而，这些方法耗时、成本高，且通常局限于设备完善的实验室，难以在资源有限的小型鸽场推广应用。因此，开发一种快速、经济、无需仪器的现场检测方法对于鸽场PiAdV-1的防控具有重要的应用价值。胶体金免疫层析试纸条（ICS）是一种在兽医临床中广泛应用的检测技术，具有省时、操作简便、不依赖仪器等优势。

二、研究内容概述

研究人员从PiAdV-1感染死亡鸽中克隆了Hexon（Genbank No. PZ941568）和Fiber-2（Genbank No. PZ943323）基因，将截短的Hexon（42-252 aa，685 bp）和Fiber-2（1-333 aa，1051 bp）片段克隆至原核表达载体pET-28a(+)中，在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达并纯化获得rHexon和rFiber-2蛋白。利用这两种重组蛋白免疫6周龄雌性BALB/c小鼠，通过传统杂交瘤融合技术筛选获得两株单克隆抗体1H2（抗Hexon，IgG2b亚型）和2F1（抗Fiber-2，IgG2a亚型）。采用柠檬酸三钠还原法合成20 nm胶体金颗粒，在最佳pH 8.5和最佳浓度6 μg/mL条件下标记1H2抗体，构建了双抗体夹心法ICS：以胶体金标记的1H2作为指示探针，以2F1包被于检测线捕获PiAdV-1，以羊抗鼠IgG包被于质控线。临床样本来源于2024-2026年间河北省6个赛鸽棚和9个养鸽场的300份腹泻鸽粪便或肛拭子样本。

三、主要研究结果

重组蛋白表达与纯化： SDS-PAGE分析显示，表达纯化的rHexon和rFiber-2蛋白分子量分别为27 kDa和45 kDa，均以可溶形式表达，Western blot验证了特异性条带。

单克隆抗体制备与鉴定： 通过ELISA监测小鼠免疫应答，当抗体效价达到高水平时分离脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。经HAT/HT筛选和三轮有限稀释亚克隆，成功建立两株杂交瘤细胞系。从腹水中纯化获得mAbs 1H2和2F1，效价均达1:10⁶，且对rHexon和rFiber-2蛋白具有良好特异性，与His标签蛋白、鸽圆环病毒Cap蛋白和鸽轮状病毒VP7蛋白均无交叉反应。

胶体金标记条件优化： 通过观察颜色变化确定最佳标记pH为8.5，最佳抗体浓度为6 μg/mL，此时溶液呈稳定红色且OD_520nm值最高。

ICS特异性验证： 对PiAdV-1、PiAdV-2、鸽副黏病毒（PPMV）、鸽圆环病毒（PiCV）和鸽轮状病毒（PRV）进行检测，结果显示仅PiAdV-1呈阳性，其余病毒均为阴性，证明该ICS具有良好的特异性。

ICS灵敏度测定： 将PiAdV-1阳性鸽肝组织匀浆上清进行系列稀释后检测，结合qPCR定量确定检测限为5.76×10³ copies/μL。

ICS稳定性与重复性评估： 同一批次试纸条在37°C条件下稳定保存5个月，在4°C条件下可稳定保存6个月。不同批次制备的ICS对灵敏度和特异性分析所用样本的检测结果一致，表明具有良好的重复性。

临床样本验证： 对300份临床粪便样本进行ICS和PCR平行检测，ICS检出68份阳性（22.67%），PCR检出76份阳性（25.33%），两者阳性符合率为89.5%，总符合率达97.34%。

四、讨论与结论

研究人员指出，ICS与PCR之间存在8份样本结果不一致，这可能源于两种方法固有灵敏度的差异——ICS的检测限为5.76×10³ copies/μL，而qPCR可检测至1 copies/μL水平。ICS阴性样本在感染早期病毒载量极低时可能出现漏检，需qPCR确证。此外，ICS仅提供定性结果，无法满足精确定量的研究需求。尽管如此，ICS无需仪器设备，经过基本培训的养殖人员可在15-20分钟内完成检测，且成本低、重量轻、可在常温下储存运输，非常适合分散分布、资源有限、露天养殖的鸽场现场检测需求。

研究结论：本研究成功重组表达了PiAdV-1的Hexon和Fiber-2蛋白，并用于单克隆抗体的筛选；基于筛选获得的单克隆抗体和免疫胶体金标记技术，成功开发了用于PiAdV-1检测的ICS。评估结果表明该ICS具有良好的特异性、灵敏度、稳定性和临床样本检测适用性，为临床样本中PiAdV-1的检测提供了一种省时、操作简便、不依赖仪器的检测工具。