基于糖化蛋白质组学与机器学习的腹膜透析患者心血管疾病预测：一项前瞻性多中心研究

《Clinical and Translational Medicine》：Predicting cardiovascular disease in peritoneal dialysis patients using glycated proteomics and machine learning: A prospective multicentre study

摘要专业翻译 背景：心血管疾病（cardiovascular disease, CVD）是腹膜透析（peritoneal dialysis, PD）患者死亡的首要原因，然而PD特异性的生物标志物和预测模型仍然有限。本研究旨在识别与PD患者CVD相关的糖化肽生物标志物，并利用机器学习整合糖化蛋白质组学与临床指标构建预测模型。 方法：在第一阶段，研究人员利用匹配的发现队列（48例合并CVD的PD患者与48例未合并CVD者）通过液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）鉴定糖化肽，并使用glmnet优先筛选候选生物标志物。在第二阶段，研究人员在前瞻性内部衍生队列（n = 240）和多中心外部验证队列（n = 102）中对候选生物标志物进行定量。采用F检验特征选择与弹性网络逻辑回归（elastic-net logistic regression）构建联合模型，并将其预测性能与三个已发表的心血管风险模型进行比较。使用训练集衍生的Youden截断值对患者进行风险分层。 结果：在发现队列中，257个糖化肽在组间存在差异丰度。研究人员优先筛选出4个候选生物标志物，其中GEAFTLK(g)ATVLNYLPK和K(g)QHLFVK两个肽段与6项临床指标（磷、糖尿病、总Kt/V、白蛋白、心肌肌钙蛋白T和糖化白蛋白）共同保留在最终模型中。联合模型在训练集、内部测试集和外部验证队列中的受试者工作特征曲线下面积（area under the receiver operating characteristic curve, ROC-AUC）分别为0.784、0.781和0.822。使用训练集衍生的0.373截断值，两个验证队列中高风险组的1年CVD发生率均显著更高。联合模型的ROC-AUC亦高于已发表的心血管风险模型。 结论：研究人员通过整合糖化肽生物标志物与临床指标，开发并外部验证了一个PD特异性的CVD预测模型，该模型可能有助于更早的风险分层和靶向预防。

论文解读

一、研究背景与目的

慢性肾脏病（chronic kidney disease, CKD）在全球范围内造成每年数百万人的死亡，预计到2040年将成为第五大死因。对于进展至终末期肾病的患者，肾脏替代治疗是唯一选择，腹膜透析（peritoneal dialysis, PD）与血液透析（haemodialysis, HD）是主要治疗方式。尽管PD和HD均能带来生存获益，但透析患者仍承受着严重并发症的持续负担，其中心血管疾病（cardiovascular disease, CVD）是最常见的并发症和首要死因。2023年美国透析患者死亡数据中，HD患者58.6%、PD患者54.6%的死亡归因于CVD。与HD相比，PD对尿毒症溶质和液体的清除更为平稳，理论上可能降低心血管事件和死亡风险；但PD也可能因容量清除不足、腹膜持续性慢性炎症以及血糖水平波动而增加心血管风险。因此，早期预测和诊断CVD并及时干预，可能有助于降低心血管死亡率。

目前已有多种CVD预测生物标志物（如NT-proBNP、可溶性ST2、血管生成素-2等）应用于临床，但仍存在敏感性和特异性不足、易受残余肾功能和透析状态影响等局限。蛋白质糖化是一种被动的病理性修饰，常见于高血糖和衰老等代谢紊乱状态，包括可逆的早期糖化产物（early glycation products, EGPs）形成和不可逆的晚期糖化终末产物（advanced glycation end products, AGEs）生成两个阶段。AGEs在CKD中升高，即使在无高血糖的情况下也与心血管风险和死亡相关。在PD人群中，较高的AGE负荷与心血管疾病、颈动脉粥样硬化和血管钙化独立相关。然而，AGEs作为晚期不可逆产物，主要反映长期代谢应激，限制了其早期风险评估的效用。相比之下，EGPs可能更适合CVD的早期预测。既往研究虽在HD患者中鉴定出差异糖化肽并验证了其中4个与CVD相关，但该研究通过传统生物信息学分析和文献综述鉴定生物标志物，存在关键局限。此外，PD患者因腹膜透析液的高葡萄糖暴露可能加剧体内蛋白质糖化，进而促进CVD的发生发展。因此，研究人员旨在利用机器学习策略鉴定PD患者CVD预测的糖化肽生物标志物，将其与传统CVD危险因素整合构建风险预测模型，并在多个PD中心进行验证。

二、主要技术方法

本研究采用两阶段设计。第一阶段为匹配的病例对照发现队列，来自复旦大学附属中山医院2019年6月至2021年12月间接受规律PD治疗的患者，按年龄、性别和透析龄1:1匹配，共纳入48例CVD患者和48例对照，利用储存的CVD发生前血清样本通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行糖化蛋白质组学分析，并比较16种机器学习模型，最终选择glmnet模型进行候选生物标志物筛选。第二阶段为前瞻性研究，包括单中心内部衍生队列（复旦大学附属中山医院2022年1月至2024年9月，纳入301例，最终240例纳入分析）和多中心外部验证队列（上海交通大学医学院附属仁济医院、复旦大学附属闵行医院、宝山区吴淞中心医院、大连医科大学附属第二医院2024年5月至2024年10月，纳入113例，最终102例纳入分析），采用平行反应监测（parallel reaction monitoring, PRM）靶向定量方法对候选生物标志物进行绝对定量，并通过F检验特征选择与弹性网络逻辑回归（ENetLR）构建预测模型。

三、研究结果

候选生物标志物筛选（发现队列）：发现队列共鉴定4431个糖化肽，其中1032个在两组中共同检出。与非CVD组相比，237个糖化肽显著上调，20个显著下调。通过比较16种机器学习模型，glmnet模型表现最佳，ROC-AUC为0.923，准确率为0.875，F1得分为0.879。glmnet模型最终选出55个糖化肽，基于特征重要性排序选取前4个肽段作为候选生物标志物，分别为来自α1β-糖蛋白的SGLSTGWTQLSK(g)LLELTGPK、来自α2-巨球蛋白（α2M）的GEAFTLK(g)ATVLNYLPK、来自载脂蛋白B-100（ApoB）的K(g)QHLFVK和来自α1-抗胰蛋白酶的ELDRDTVFALVNYIFFK(g)GK。由于前两者在许多样本中低于检测限，最终选择GEAFTLK(g)ATVLNYLPK和K(g)QHLFVK作为候选生物标志物。

衍生队列中候选生物标志物的靶向定量：在240例纳入分析的衍生队列患者中，53例发生CVD。与未发生CVD的患者相比，发生CVD的患者两种生物标志物水平均显著升高。

联合模型的构建：将56项临床指标与两种生物标志物整合，对34种模型配置进行综合基准分析。最终F检验特征选择联合ENetLR分类器表现最佳。联合模型纳入磷、糖尿病、总Kt/V、白蛋白、心肌肌钙蛋白T（cTnT）、糖化白蛋白（GA）6项临床指标及GEAFTLK(g)ATVLNYLPK和K(g)QHLFVK两种糖化肽生物标志物。在训练集中，联合模型ROC-AUC为0.784，显著高于仅临床模型（0.624，p = .003）。基于训练集ROC分析确定Youden指数最优截断值为0.373。

模型评估：在内部测试集中，联合模型ROC-AUC为0.781。在外部验证队列中（102例纳入，17例发生CVD），联合模型ROC-AUC为0.822。两种生物标志物水平在发生CVD的患者中均显著更高。使用训练集衍生的0.373截断值进行风险分层，高风险组在内部和外部验证队列中的1年CVD发生率均显著高于低风险组，内部验证队列相对风险（RR）为3.35，外部验证队列为5.50，阴性预测值分别达89.5%和93.0%。与FRS、WHO CVD风险模型及Xia等2017年开发的PD特异性列线图模型相比，联合模型在训练队列中ROC-AUC显著高于全部三个参考模型，在外部验证中显著高于FRS和WHO模型，对Xia模型具有数值优势。

在线CVD风险计算器：研究人员基于包含8个变量的联合模型开发了网络应用程序并在线部署，网址为https://glycapeppd-cvd-risk-calculator.streamlit.app，便于临床医生便捷评估PD患者的CVD风险。

四、讨论总结与研究结论

讨论部分指出，本研究通过糖化肽富集、高通量蛋白质组学和机器学习分析，鉴定出两种新型糖化肽生物标志物，并将其与临床指标整合构建了PD特异性CVD预测模型。ApoB是低密度脂蛋白的主要蛋白成分，其糖化可能促进LDL滞留并增加CVD风险；K(g)QHLFVK中的糖化赖氨酸位于ApoB的β1脂质结合区域，糖化可能改变ApoB局部构象，间接影响LDL受体介导的脂蛋白清除。α2M是丰富的循环蛋白酶抑制剂和急性期蛋白，既往研究显示其能以高准确度识别糖尿病患者的冠心病；GEAFTLK(g)ATVLNYLPK中的糖化赖氨酸位于参与蛋白质构象重排的铰链区附近，糖化可能改变局部电荷和空间特性，影响构象动力学和蛋白酶调节功能。模型纳入的临床指标均有明确的临床相关性：高磷血症促进血管钙化，糖尿病和CKD是CVD的既定危险因素，GA是PD患者短期血糖控制更合适的标志物，低白蛋白反映营养和炎症状态，cTnT广泛用于CVD诊断和风险分层，总Kt/V是透析充分性的关键指标。研究局限性包括：缺乏糖化肽生物标志物的基础研究机制证据；队列规模和事件数有限，影响性能估计精度和泛化性评估；PRM-LC-MS/MS技术成本较高、技术要求严格，限制临床适用性；排除入组后退出患者可能引入偏倚。

研究结论为：研究人员表征了PD患者中与CVD相关的糖化蛋白质组学特征，利用机器学习方法鉴定了具有预测价值的糖化肽生物标志物，并通过整合生物标志物与临床指标开发了CVD预测模型。该模型的性能在内部和外部队列中均得到验证，为PD患者更早期的心血管风险分层和靶向预防干预提供了基础。