杯状细胞Piezo1通过Ca2+–IRE1α–XBP1通路介导未折叠蛋白反应调控肠道黏液屏障稳态

《Clinical and Translational Medicine》：Piezo1-mediated unfolded protein response in goblet cells regulates intestinal mucus barrier homeostasis through the Ca2+–IRE1α–XBP1 pathway

　　

背景：研究人员前期研究揭示，结肠杯状细胞中的Piezo1可感知机械刺激并调控MUC2的生成与分泌，但其潜在机制尚不清楚。在杯状细胞特异性Piezo1敲除小鼠中观察到内质网功能改变及未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）异常，而UPR对MUC2蛋白折叠与分泌至关重要。本研究旨在探讨杯状细胞Piezo1是否以及如何通过调控UPR来调节黏液屏障功能。 方法：体外实验中，对LS174T细胞施加轨道摇动以模拟流体剪切力（fluid shear stress，FSS）刺激。在存在或缺失Piezo1及UPR抑制的情况下，采用实时PCR、蛋白质印迹和免疫荧光染色检测UPR相关分子及MUC2的表达。体内实验中，对杯状细胞特异性Piezo1敲除（cKO）小鼠给予葡聚糖硫酸钠（dextran sulphate sodium，DSS）和水回避应激（water avoidance stress，WAS）处理。研究人员分析了杯状细胞形态、黏液层厚度、UPR相关蛋白表达及内质网结构的变化。此外，对DSS诱导的结肠炎小鼠腹腔注射Yoda1以激活Piezo1，随后评估病理结构和黏液层厚度的改变。 结果：与PERK或ATF6相比，FSS激活PIEZO1并促进钙内流，从而维持内质网钙稳态，并选择性激活IRE1α–XBP1信号通路。该级联反应促进MUC2生成，而药理学抑制PIEZO1或IRE1α表达可显著消除上述效应。与WT小鼠相比，cKO小鼠在DSS和WAS条件下表现出更严重的黏液屏障损伤、IRE1α-XBP1下调及内质网肿胀加重。相反，通过Yoda1处理药理学激活Piezo1可恢复DSS小鼠肠道黏液层厚度并改善结肠炎。 结论：Piezo1感知机械刺激以维持内质网钙稳态，并通过IRE1α–XBP1通路调控UPR，从而促进杯状细胞中MUC2生成并维持肠道黏膜屏障稳态。 要点： •结肠杯状细胞中的Piezo1感知肠道机械刺激，并通过Ca2+内流调控内质网钙稳态。 •Piezo1-Ca2+-IRE1α-XBP1信号轴控制Mucin2合成与生成，以维持肠道黏液屏障完整性。 •通过Yoda1药理学激活Piezo1可挽救黏液屏障缺陷，为胃肠道黏膜损伤提供潜在治疗策略。

论文解读

一、研究背景与科学问题

肠道黏液层是覆盖在肠上皮表面的重要保护性屏障，主要由水、黏蛋白、脂质、蛋白质和电解质组成。其中，杯状细胞（goblet cells，GCs）分泌的黏蛋白-2（MUC2）是黏液层的核心结构成分。杯状细胞能够响应多种物理、化学和生物刺激动态调控黏液分泌，其功能受损和黏液层完整性破坏与炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）和肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）等消化系统疾病密切相关。然而，驱动杯状细胞介导的黏液屏障功能障碍的具体调控机制尚不清楚。

在杯状细胞中，内质网（endoplasmic reticulum，ER）是负责黏蛋白合成、折叠和质量控制的关键细胞器。由于黏蛋白生物合成速率极高，其产生 inherently 会扰乱内质网折叠平衡并诱导内质网应激（ER stress），从而触发未折叠蛋白反应（UPR）。UPR通过上调内质网驻留分子伴侣以增加折叠能力，并介导内质网相关降解（ERAD）清除错误折叠的黏蛋白，从而确保功能性黏蛋白的有效成熟和分泌。遗传学研究已证明，在肠上皮细胞中靶向敲除UPR关键介质X盒结合蛋白1（XBP1）可导致MUC2表达显著下调和黏液屏障完整性明显破坏。但调控杯状细胞UPR通路激活并进而调节黏蛋白分泌的具体上游信号分子尚未完全阐明。

Piezo1是一种机械门控的非选择性阳离子通道，响应机械刺激介导钙离子（Ca²⁺）内流进入细胞质。研究人员前期研究已发现Piezo1可调控MUC2分泌，但具体机制不明。鉴于内质网是细胞内主要的Ca²⁺储存库，Piezo1是否通过Ca²⁺信号调控内质网功能进而影响杯状细胞黏蛋白分泌，成为本研究关注的核心科学问题。

二、研究概述与主要结论

本研究系统阐明了杯状细胞Piezo1通过Ca²⁺–IRE1α–XBP1通路调控UPR进而维持肠道黏液屏障稳态的分子机制。研究证实，机械刺激激活PIEZO1后促进钙内流，维持内质网钙稳态，并选择性激活IRE1α–XBP1信号通路，从而促进MUC2生成。在DSS诱导的结肠炎和WAS诱导的IBS小鼠模型中，杯状细胞特异性Piezo1敲除导致内质网稳态破坏、IRE1α–XBP1通路受损、MUC2产生减少，并加重黏液屏障损伤和炎症反应。相反，药理学激活Piezo1可恢复肠道黏液层厚度并改善结肠炎。该研究不仅揭示了机械感知调控肠道屏障的新机制，还鉴定出Piezo1和XBP1作为IBD、IBS等黏液屏障损伤相关疾病的潜在治疗靶点。

三、主要关键技术方法

研究人员采用了以下关键技术方法：构建他莫昔芬诱导的杯状细胞特异性Piezo1条件敲除（cKO）小鼠模型（Muc2-CreERT2; Piezo1^flox/flox），小鼠品系为雄性C57BL/6，购自上海模式生物研究中心；建立DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型和WAS诱导的IBS小鼠模型；对WT和cKO小鼠结肠组织进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），使用DNBelab C4平台和DNBSEQ-T7测序仪，经Scanpy流程进行数据分析；对PIEZO1敲低的LS174T细胞系进行批量转录组测序；采用轨道摇动对LS174T细胞施加流体剪切力（FSS）刺激模拟肠道机械力；运用透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）观察内质网超微结构和杯状细胞形态；通过蛋白质印迹、免疫荧光、RT–qPCR、ELISA检测蛋白和基因表达；利用流式细胞术和钙离子荧光探针（FLUO-4 AM和CMV-ER-LAR-GECO1质粒）检测细胞质和内质网钙水平；采用免疫共沉淀（CoIP）检测蛋白相互作用。

四、研究结果

结果1：杯状细胞Piezo1敲除不诱导病理性肠道损伤，但引发低度炎症、杯状细胞肿胀和黏液产生受损。 通过免疫荧光共定位证实杯状细胞中Piezo1成功敲除。cKO小鼠结肠无明显病理损伤，但促炎细胞因子IL-1β和TNF-α蛋白水平升高，肠道黏液层厚度减少，杯状细胞数量下降，电镜显示杯状细胞明显肿胀并倾向脱离肠绒毛，Muc2基因表达显著下调。

结果2：Piezo1敲除损害杯状细胞内质网功能。 单细胞RNA测序鉴定出9种肠道上皮细胞亚群，Piezo1敲除在隐窝间杯状细胞中显著下调790个基因、上调527个基因。KEGG和GO富集分析显示内质网相关蛋白合成通路显著扰动，UPR关键介质Xbp1和Atf4表达显著下降。LS174T细胞批量转录组测序结果一致，Piezo1缺失后IRE1α、sXBP1、PERK、GRP78、ATF6、CHOP和ATF4表达均显著下调。

结果3：PIEZO1激活通过IRE1α–XBP1通路增强内质网功能。 FSS刺激显著上调PIEZO1表达，并增加MUC2 mRNA和蛋白水平。FSS和Yoda1处理均显著激活IRE1α–XBP1通路及其下游靶标EDEM1，而PERK–CHOP和ATF6通路无显著变化，表明PIEZO1特异性通过IRE1α–XBP1通路调控MUC2产生。

结果4：抑制或敲除PIEZO1消除FSS刺激诱导的IRE1α–XBP1通路激活并减弱MUC2产生。 GsMTx4抑制PIEZO1后，FSS诱导的MUC2上调被抑制，sXBP1和EDEM1表达降低，IRE1α磷酸化被阻断。PIEZO1敲低实验获得一致结果，证实FSS通过PIEZO1调控IRE1α–XBP1通路和MUC2产生。

结果5：抑制或敲除IRE1α消除FSS刺激介导的PIEZO1激活诱导的MUC2产生。 4μ8C特异性抑制IRE1α后，FSS诱导的MUC2表达上调被抑制，sXBP1和DNAJB9表达降低，而PIEZO1表达不变。siRNA敲低IRE1α获得一致结果，确认IRE1α是介导PIEZO1调控下游sXBP1活性和MUC2产生的关键分子。

结果6：PIEZO1介导Ca²⁺内流调节内质网钙稳态，从而调控IRE1α–XBP1通路和MUC2产生。 CoIP实验显示IRE1α与PIEZO1无直接物理相互作用，提示间接调控机制。FSS刺激增加细胞质和内质网Ca²⁺水平，BAPTA-AM钙螯合剂消除此效应并抑制MUC2产生和IRE1α–XBP1通路激活。PIEZO1抑制可改变FSS刺激下的内质网钙含量。LS174T细胞中PIEZO1表达显著高于其他机械敏感钙通道，TRPA1激动剂肉桂醛对UPR通路和MUC2产生无显著影响，凸显PIEZO1在杯状细胞中的关键作用。

结果7：杯状细胞Piezo1敲除加重DSS诱导的炎症和黏液屏障损伤。 与WT-DSS小鼠相比，cKO-DSS小鼠体重下降更严重、疾病活动指数更高、结肠长度更短、组织学炎症浸润和损伤更重，黏液层厚度显著降低，Muc2阳性杯状细胞比例明显减少，促炎细胞因子TNF-α和IL-1β分泌显著升高。

结果8：杯状细胞Piezo1敲除加重DSS诱导的内质网损伤并抑制IRE1α–XBP1通路。 电镜显示cKO-DSS小鼠内质网肿胀更严重、线粒体嵴丢失更明显。DSS处理上调磷酸化Ire1α和sXbp1蛋白水平，但Piezo1敲除小鼠中这些上调被削弱，免疫荧光共定位进一步证实杯状细胞中IRE1α–XBP1通路激活被抑制。

结果9：杯状细胞Piezo1敲除加重IBS小鼠模型中的黏液屏障和内质网损伤。 WAS处理后WT和cKO小鼠均表现出腹部撤退反射敏感性和痛阈增加，确认IBS模型成功建立。cKO-WAS小鼠黏液层破坏更严重、Muc2产生减少，杯状细胞肿胀、内质网结构损伤和面积增大。WAS处理的WT小鼠中磷酸化Ire1α和sXbp1上调，但cKO小鼠中下调。

结果10：激活Piezo1改善WAS/DSS小鼠肠道黏液屏障并减轻结构损伤。 Yoda1处理未能逆转DSS小鼠体重下降，但有效改善疾病活动指数、逆转结肠缩短和病理损伤，恢复结肠黏液层厚度。DSS小鼠结肠上皮中Piezo1蛋白表达下调，Yoda1干预显著逆转此改变。

五、讨论总结与研究结论

讨论部分指出，杯状细胞通过基线性组成型分泌和刺激性分泌两种模式分泌MUC2，该过程与内质网功能紧密耦合。本研究首次建立了Piezo1机械感知与UPR激活之间的新联系。生理条件下，机械刺激激活Piezo1启动钙内流，增加内质网钙水平并触发IRE1α–XBP1s上调，该级联促进MUC2合成和产生。内质网Ca²⁺超载可重新分布内源性GRP78而不改变其总蛋白丰度，削弱GRP78与IRE1α腔内结构域之间的静电相互作用，促进二者解离，释放的IRE1α快速形成同源二聚体并自磷酸化启动下游信号。而PERK和ATF6的GRP78结合域对内质网Ca²⁺波动不敏感，故这两条UPR分支激活有限。XBP1s作为IRE1α的关键下游效应分子，通过两种机制调控MUC2产生：作为强效转录因子转位至细胞核诱导MUC2 mRNA合成；结合内质网应激反应元件和未折叠蛋白反应元件，增加内质网机制相关基因表达，提高MUC2在内质网中的折叠效率。在IBD和IBS小鼠模型中，杯状细胞Piezo1敲除导致IRE1α–XBP1通路信号缺陷，消除UPR的适应性保护效应，加重肠道屏障破坏和促炎细胞因子产生。药理学激活Piezo1恢复肠道黏液屏障稳态并改善DSS和WAS背景下的屏障缺陷。研究结论为：杯状细胞Piezo1通过内质网钙–IRE1α–XBP1s通路调控MUC2产生，从而维持肠道黏液屏障稳态，该结果在IBD和IBS小鼠模型中得到验证。这项工作不仅推进了对机械感知调控胃肠道屏障作用的理解，还鉴定出Piezo1和XBP1作为IBD、IBS及其他黏液屏障损伤相关疾病的潜在治疗靶点。