《Biotechnology and Applied Biochemistry》：Biomanufacturing of L-Lactic Acid from Inulin Exploiting Kluyveromyces marxianus and Engineered Saccharomyces cerevisiae Cell Factories
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向可持续乳酸（LA）生物制造的转型，需要从第一代原料转向残余生物质和低pH发酵，以消除昂贵且产生大量废弃物的盐纯化与酸化步骤。本研究提出了一种新颖的双酵母策略，旨在利用菊粉（一种也存在于菜蓟根中的果聚糖）在低于其pKa值的pH条件下高效生产乳酸。本工作的核心创
向可持续乳酸（LA）生物制造的转型，需要从第一代原料转向残余生物质和低pH发酵，以消除昂贵且产生大量废弃物的盐纯化与酸化步骤。本研究提出了一种新颖的双酵母策略，旨在利用菊粉（一种也存在于菜蓟根中的果聚糖）在低于其pKa值的pH条件下高效生产乳酸。本工作的核心创新在于识别并配对每种生物的独特生理优势：马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）作为菊粉水解的最适酵母，以及酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为在低pH和高滴度条件下稳健生产乳酸的优势宿主。研究人员发现，若以尿素替代硫酸铵作为马克斯克鲁维酵母培养的氮源，菊粉酶活性可提高近20倍，显著增强底物的初始分解。随后，富含菊粉酶的马克斯克鲁维酵母上清液被用于培养工程化同型乳酸菌株酿酒酵母m850，并将菊粉转化为L-乳酸。比较分步水解发酵（SHF）与同步糖化发酵（SSF）两种策略，研究人员实现了大于0.77 g/g的最大产率，最终pH为2.5。虽然SSF受限于pH诱导的菊粉酶失活，但SHF工艺实现了底物的完全转化。这些结果展示了一个利用残余原料生产乳酸的可行平台，大幅降低了环境影响和下游加工成本。
论文解读
一、研究背景与意义
乳酸（LA）是重要的化工基础原料，广泛应用于食品饮料、化妆品、医药及聚合物等领域，尤其是作为可生物降解塑料聚乳酸（PLA）合成的前体。当前乳酸市场规模估计约为每年40万吨。虽然乳酸可通过化学合成获得，但目前主要来源于微生物发酵。乳酸菌（LAB）是当前工业规模生产中最常用的微生物，但其发酵性能受pH显著影响，需将pH维持在5.0至7.0之间。乳酸菌产酸过程中伴随的强烈酸化需要使用大量中和剂，导致产物以乳酸盐而非乳酸形式存在，不仅增加了下游加工的复杂性，也降低了生物制造工艺的整体可持续性。
过去几十年，工程酵母因其对低pH环境具有更强的耐受性而受到广泛关注。在酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母中过表达细菌乳酸脱氢酶（LDH）并失活丙酮酸脱羧酶（PDC）基因，已被证明可有效将碳代谢流从乙醇生产转向乳酸合成。然而，酿酒酵母在低pH条件下表现出更优的乳酸耐受性，而马克斯克鲁维酵母则具有利用多种碳源（包括残余生物质来源）的天然能力。已有研究利用产菊粉酶的马克斯克鲁维酵母工程菌株从菊芋粉中生产乳酸，取得了较高产率，但由于马克斯克鲁维酵母对低pH敏感，该工艺需在近中性pH条件下运行，产物为乳酸盐而非乳酸，需进一步纯化，削弱了其与细菌生产的竞争力。
菊粉，特别是来源于非食用植物菜蓟（Cynara cardunculus）的菊粉，因其主要由果糖分子组成而被视为有前景的可发酵糖来源。菜蓟是适应地中海边际土壤的高产多年生作物，可提供可持续的非食品原料供应。针对菊粉利用的挑战，本研究采用双酵母策略，将微生物多样性协同应用于复杂底物的增值转化：利用马克斯克鲁维酵母进行生物质糖化，利用酿酒酵母进行有机酸生物合成。
二、研究内容与主要结论
本研究开发了一种在低pH条件下高滴度生产乳酸的新型双酵母方法。以菊粉为原料，马克斯克鲁维酵母CBS6556作为天然菊粉酶生产者，工程酿酒酵母CEN.PK m850作为乳酸生产者。研究发现，以尿素替代硫酸铵作为马克斯克鲁维酵母的氮源，菊粉酶活性提高近20倍，这归因于尿素培养条件下培养基酸化程度较低，从而维持了菊粉酶的稳定性。在低pH条件下，菊粉酶活性在48小时内损失62%。
研究人员比较了同步糖化发酵（SSF）和分步水解发酵（SHF）两种策略。SSF工艺在75 g/L和95 g/L菊粉条件下分别产出52.9 ± 2.40 g/L和65.8 ± 1.30 g/L的L-乳酸，转化产率均为0.77 g/g。SHF工艺在70 g/L菊粉水解液条件下产出51.9 ± 0.57 g/L乳酸，产率为0.80 ± 0.075。所有发酵最终pH均在2.5左右，远低于乳酸pKa值，确保产物以所需的未解离形式存在，简化了下游处理步骤。研究结果表明，SHF策略优于SSF，因为SSF中快速的pH下降对菊粉酶活性产生负面影响，导致3.3%至5.8%的底物未被水解。
三、主要技术方法
本研究主要采用了以下关键技术方法：利用马克斯克鲁维酵母CBS6556（来源于爱尔兰科克大学）进行菊粉酶生产，比较硫酸铵与尿素两种氮源对菌株生长和酶活的影响；采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定还原糖以评估菊粉酶活性；利用工程酿酒酵母CEN.PK m850（具有PDC基因完全缺失和植物乳杆菌乳酸脱氢酶表达特征）进行乳酸生产；采用高效液相色谱（HPLC）测定底物消耗和乳酸产量；采用果聚糖HK检测试剂盒测定菊粉浓度；采用分步水解发酵（SHF）和同步糖化发酵（SSF）两种工艺配置进行乳酸生物制造。
四、研究结果
4.1 不同氮源对马克斯克鲁维酵母CBS6556生长和外切菊粉酶活性的影响
以菊粉为唯一碳源，比较硫酸铵和尿素两种氮源对马克斯克鲁维酵母生长和菊粉酶生产的影响。两种条件下菌株生长曲线几乎一致，比生长速率分别为0.43 ± 0.006 h?1和0.44 ± 0.004 h?1。但培养24小时后，硫酸铵培养基pH降至2.5，而尿素培养基pH维持在6。尿素条件下菊粉酶活性达10.81 ± 0.447 IU/mL，比硫酸铵条件（0.68 ± 0.202 IU/mL）高出近20倍。尿素作为氮源具有pH稳定性好、过程可控和成本更低的优势。
4.2 菊粉酶水解
将两种氮源条件下获得的富含菊粉酶上清液用于菊粉水解评估。硫酸铵来源上清液在50°C、pH 5条件下孵育24小时释放9.6 ± 1.52 g/L果糖，而尿素来源上清液释放18.2 ± 0.68 g/L果糖，达到化学水解（19.4 ± 1.66 g/L）产率的94%，进一步证实尿素是更优的氮源选择。
4.3 工程酿酒酵母m850以果糖为底物的乳酸生产
以71 g/L纯果糖为底物验证酿酒酵母CEN.PK m850的发酵性能。48小时后，菌株产出65.5 ± 3.41 g/L乳酸，消耗70.4 g/L果糖，产率（Yp/s）为0.93 ± 0.030。发酵24小时后培养基pH降至2.5，表明该菌株在果糖底物上具有与葡萄糖底物相当的乳酸生产能力。
4.4 SSF工艺从菊粉生产L-乳酸
以75 g/L菊粉为唯一碳源进行SSF发酵，加入马克斯克鲁维酵母上清液（菊粉酶活性10.81 ± 0.447 IU/mL）作为酶源。48小时后产出52.9 ± 2.40 g/L乳酸，消耗约73.7 g/L菊粉，产率为0.77 ± 0.036。将菊粉浓度提高至95 g/L时，72小时后产出65.8 ± 1.30 g/L乳酸，消耗89.1 g/L菊粉，产率仍为0.77 ± 0.012。但两种条件下均存在未完全水解的菊粉残留，且游离单糖被完全消耗，表明发酵受限于底物水解而非细胞工厂性能。进一步实验证实，将菊粉酶上清液调至pH 2.5后，酶活性在24小时和48小时后分别下降34%和62%，证实低pH导致菊粉酶失活是SSF工艺的主要限制因素。
4.5 SHF工艺从菊粉生产L-乳酸
在50°C、pH 5条件下对70 g/L菊粉进行54小时酶解，实现完全水解，无残余菊粉检出。水解液中果糖和葡萄糖浓度分别为60.23 g/L和4.57 g/L。接种酿酒酵母CEN.PK m850后，48小时内单糖被完全消耗，pH降至2.5，乳酸产量为51.9 ± 0.57 g/L，产率为0.80 ± 0.075。SHF工艺实现了底物的完全转化，避免了SSF中pH下降导致的酶失活问题。
五、讨论与结论
本研究首次证明菊粉酶活性依赖于氮源种类，尿素可通过减少培养基酸化来维持菊粉酶稳定性。SSF和SHF两种策略均能有效实现菊粉向乳酸的增值转化，但SHF因避免了低pH对酶活性的负面影响而更为优选。两种工艺均在pH 2.5条件下生产乳酸而非乳酸盐，简化了下游纯化步骤，降低了时间和能源成本。SSF策略的进一步改进方向包括增加菊粉酶投加量、工程改造马克斯克鲁维酵母实现超量分泌，或筛选具有酸耐受性的天然或工程菊粉酶。研究结论表明，这种双酵母协同策略为利用非食用原料通过酵母发酵生产多种有机酸提供了具有普遍参考价值的平台。
