新型咪唑–噻唑杂合高官能化呋喃类似物的设计合成、纳米制剂、抗菌评价及DNA旋转酶B（DNA gyrase B）抑制的分子对接与分子动力学模拟研究

《Chemistry & Biodiversity》：Synthetic Strategy to Novel Highly Functionalized Furan Analogues Bearing Imidazole–Thiazole Hybrids: Structural Characterization, Nanoparticle Formulations, Antimicrobial Evaluation, Molecular Docking Studies, and Molecular Dynamic Simulations

　　

该研究报道了具有潜在抗微生物活性的新型含咪唑–噻唑杂合的高官能化呋喃类似物的设计与合成。所合成化合物经光谱工具和元素分析制备并表征。研究人员以环丙沙星（ciprofloxacin）为阳性对照，评估了所有合成化合物对一组细菌菌株的抗微生物活性。结果显示高度结构和菌株依赖性特征。然而，化合物9b表现出最强活性。为增强理化与生物学性能，研究人员将选定的生物活性化合物（6b、8a,c；9b,c；和11a）配制为纳米颗粒（NPs）并表征，获得可接受的粒径、稳定性和分布特征，其中9b表现出有利参数。研究人员评估了6种纳米制剂的抗微生物活性，并与母体化合物比较。纳米化合物9b > 9c > 8c表现出最强活性及最低抑菌浓度（MIC）值，在若干情况下与环丙沙星相当甚至更优。研究人员对9b进行分子对接研究和分子动力学（MD）模拟，以详细观察其拟议结合行为、相互作用模式、构象重排及在DNA旋转酶B（DNA gyrase B）活性位点内相对于novobiocin的稳定性。研究结果验证9b是进一步开发为DNA旋转酶B抑制剂最有前景的候选物。

研究背景与问题：杂环（heterocycles，环状有机化合物）是活性药物中间体和生物活性化合物的重要砌块；含氮杂环与氧/硫组合的五元或六元环在生物活性骨架中占重要地位。咪唑（imidazole，含氮五元杂环）存在于组氨酸、维生素B₁₂、DNA碱基嘌呤、组胺和生物素等，也见于西咪替丁、甲硝唑等药物；噻唑（thiazole，含硫和氮五元杂环）见于青霉素G、博来霉素、非布司他、磺胺噻唑和维生素B等，具有抗癌、抗惊厥、抗糖尿病和抗炎等活性。部分药物同时含咪唑和噻唑杂合结构。有机纳米颗粒（NPs，纳米尺度颗粒）在诊断、生物成像、药物递送和癌症治疗中受关注，但许多有机化合物水溶性差，限制药代动力学、药效、分布、蛋白结合和吸收；口服制剂占比高，水溶性尤为关键。同时，多重耐药菌出现需要持续寻找新抗微生物剂。基于此，研究人员设计并合成新型高官能化呋喃（furan，含氧五元杂环）类似物，含咪唑–噻唑杂合，以增强结构多样性和潜在活性，并开展抗菌评价、纳米化和计算研究。

研究开展与结论意义：研究人员经高效合成路线制备并表征目标化合物，评估抗微生物活性；筛选生物活性化合物6b、8a,c、9b,c、11a制成纳米颗粒，表征并比较母体；9b进一步用于分子对接（molecular docking，计算配体–受体结合模式）和分子动力学（MD，molecular dynamics simulation，模拟原子运动），靶点为DNA旋转酶B（DNA gyrase B，本文研究的靶点蛋白）。结论认为9b为最有前景的DNA gyrase B抑制剂候选，纳米化提高多数化合物活性。意义为抗菌药物发现、纳米制剂和结构优化提供依据。

关键技术方法（不超过250字）：合成物经IR、¹H/¹³C NMR、EI-MS和元素分析表征；采用高能机械球磨法在水相中制备纳米颗粒（NPs），经扫描电子显微镜（SEM，观察形貌和尺寸）、能量色散X射线光谱（EDX，元素组成分析）、Zeta电位、粒径分布和多分散指数（PDI，粒径分布均一性指标）表征。抗菌采用琼脂孔扩散法和CLSI肉汤微量稀释法测最低抑菌浓度（MIC，最低抑制细菌生长的浓度）；菌株由Microbial Genetics Lab. National Research Centre提供，含E. faecalis ATCC29212、S. mutans ATCC25175、E. coli ATCC25915、P. aeruginosa ATCC10145及S. aureus ATCC25923。分子对接使用DNA gyrase B（PDB: 1AJ6）、AutoDock Vina等；MD使用AMBER18进行70 ns模拟及MM/GBSA计算。

研究结果：
2.1 化学：按文中路线合成硫代甲酰胺类起始底物6a–c及目标呋喃类似物8a–c、9a–c、11a–c；通过改进两步法将关键咪唑中间体4的产率提高至85%，中间体3产率90%；6a–c以缩合制备并以硫酮形式表征；6a–c与氯丙酮或4-溴苯酰溴环烷基化得到二氢噻唑8a–c（约77%）和9a–c（约75%），与溴乙酸乙酯反应得到噻唑烷酮11a–c（约77%），结构经IR、NMR、EI-MS和元素分析确认。
2.2 纳米制剂：选择6b、8a,c、9b,c、11a，以机械球磨法在水相中制成纳米粉体，无额外化学试剂，以控制形貌并改善生物活性。
2.2.1 选定合成化合物的纳米尺度转化：上述选定化合物经高能球磨转化为纳米体系并用于后续表征和活性评价。
2.2.2 制备化合物纳米尺度的表征分析：采用SEM、EDX、Zeta电位、粒径分布和PDI评估纳米粉体。
2.2.2.1 扫描电子显微镜成像：高能球磨将块体有机前体降至亚微米/纳米范围；11a为222–460 nm准球形，8a为380–540 nm片状粗糙，9c为452–1259 nm多分散板状，8c为146–297 nm粗糙多孔海绵状，6b为390–570 nm粗糙不规则但分布较均一，9b为411–992 nm且边界更清晰（溴苯基和环化噻唑增强结晶性）；团聚归因于范德华力。
2.2.2.2 能量色散X射线光谱分析：11a/8a含C、N、O、S；9c/8c含C、N、O、S，9c有Br峰；6b/9b含C、N、O及微量S，9b有微量Br；确认元素组成。
2.2.2.3 粒径分布与Zeta电位分析：Zeta电位11a 20.27、8a 17.67、9c ?14.46、8c ?15.48、6b ?22.24、9b ?33.20 mV；9b最高稳定性；Z-average分别为121.1、185.1、260、222、143、246 nm；PDI分别为0.20、0.31、0.20、0.28、0.27、0.47；多数<0.3，9b为0.47，原文总体认为球磨法制备纳米化成功。
2.3 抗微生物评价：
2.3.1 纳米转化前合成化合物的抗微生物评价：琼脂孔扩散法显示活性高度结构和菌株依赖，均未达到环丙沙星强度；9b对P. aeruginosa（8.50 ± 0.12 mm）和E. coli（7.50 ± 0.10 mm）抑菌圈最大并有一定革兰阳性活性；11b仅对P. aeruginosa较强（8.50 mm）；8c对E. coli（6.00 mm）和S. aureus（6.10 mm）中等；9a完全无活性；S. mutans总体最不敏感。
2.3.2 配制纳米产物的抗微生物评价：9b最广谱强效，对E. faecalis（15.31 mm）、S. aureus（11.20 mm）、S. mutans（7.10 mm）、E. coli（13.20 mm）和P. aeruginosa（8.31 mm）均有活性，多例匹配或超过环丙沙星；9c和8c对E. coli较强（14.30和16.00 mm）；6b对S. aureus中等（10.21 mm）；11a和8a大多低活性。纳米化较母体显著提高：9b对E. faecalis 4.00→15.31、E. coli 7.50→13.20、S. aureus 2.00→11.20、S. mutans 3.50→7.10 mm；8c对E. coli 6.00→16.00 mm；9c由基本无活性变为广谱；11a为例外。
2.3.3 MIC值测定：9b最低MIC为5.00 μg/mL（E. faecalis、E. coli、S. aureus），对P. aeruginosa为10.00 μg/mL；对E. faecalis和E. coli等于或优于环丙沙星（5.00 vs 10.00 μg/mL），对S. aureus相当（5.00 vs 5.00 μg/mL）。9c和8c对E. coli MIC均5.00 μg/mL、对S. aureus 10.00 μg/mL；8c对S. mutans 10.00 μg/mL，为9c和9b（20.00 μg/mL）的两倍活性。6b弱，11a和8a差。
2.4 分子动力学与系统稳定性：70 ns模拟中RMSD（均方根偏差，衡量结构偏离）Apo为1.55 ± 0.30 ?、复合物1.30 ± 0.24 ?；RMSF（均方根涨落，衡量残基波动）Apo为1.50 ± 0.65 ?、复合物0.99 ± 0.72 ?，相互作用区Asp73、Thr165、Arg76、His136波动降低；Rg（回转半径，衡量紧凑度）16.61 ± 0.08→16.22 ± 0.07 ?；SASA（溶剂可及表面积，衡量溶剂暴露）10391.80→9832.32 ?²；提示9b使蛋白略更紧凑和受约束。
2.4.1 基于结合自由能计算的结合相互作用机制：MM/GBSA（分子力学/广义Born表面积法，结合自由能计算）得ΔG_bind = ?48.16 ± 0.40 kcal/mol，ΔE_vdW = ?56.91 ± 0.33、ΔE_elec = ?8.50 ± 0.26、ΔG_gas = ?65.41 ± 0.47、ΔG_solv = +17.24 ± 0.21 kcal/mol；以疏水堆积为主并伴 modest 静电作用，去溶剂化惩罚不利结合。
2.4.2 配体结合关键残基识别：残基能量分解显示THR147总贡献最负（?12.593 kcal/mol），ASN35（?9.777）、GLU31（?8.992）、LEU41（?10.142）、LEU87（?10.032）、VAL32/33等构成分布式热点网络；GLY70和SER103贡献弱。
2.4.3 配体–残基相互作用网络谱：9b与Phe93、Ile67、Pro68形成pi-alkyl，与Glu39形成吸引电荷和pi-anion，与Arg65形成pi-alkyl/pi-cation，与Asp38形成氢键和吸引电荷。
2.4.4 自由能景观（FEL，自由能随构象变化图）分析：复合物达到明显稳定构象态，FEL中见显著低能盆地（蓝/紫色区域）。
2.4.5 概率密度函数（PDF，构象状态分布概率）分析：主导构象簇位于Rg 16.35 ?、RMSD 1.41 ?，提示稳定紧凑结构。
2.4.6 动力学交叉相关矩阵（DCCM，残基运动相关性）分析：相关运动远多于反相关；9b结合引起内部结构重排，强相关区段为0–80和160–180位残基，对应柔性且富含疏水残基的活性位点区域。
2.4.7 与novobiocin的结合模式比较：二者占据同一催化口袋并共享Asp73氢键和Arg76 pi-cation；9b另有Thr165氢键、Arg76/His136 pi-cation、Glu50 pi-anion、Met95 sulfur–X及Ile78/Ile94/Pro79疏水接触，预测结合能?9.8 vs ?7.2 kcal/mol；9b不依赖Arg136，提示对novobiocin耐药株可能有效。
2.4.8 活性化合物的比较分子对接分析：9b、9c、8c结合能分别为?9.8、?8.9、?8.2 kcal/mol，与MIC数据一致；9b因环己基和溴苯基形成最全面网络，9c缺环己基而疏水接触减少，8c缺溴苯基和环己基且氢键少，结合最弱。

讨论与结论：讨论认为计算观察支持9b与DNA gyrase B活性位点稳定结合及可能机制，但需DNA gyrase抑制实验和等温滴定量热法（ITC，直接测定结合热力学）验证；当前研究局限包括需细胞毒性和更广抗菌谱筛选。研究结论（翻译）：总之，研究人员设计、合成、表征并评价了一系列新型含咪唑–噻唑杂合的高官能化呋喃类似物作为抗微生物候选物；纳米制剂策略改善溶解度、稳定性及总体生物学性能；选定6b、8a,c、9b,c、11a经机械球磨制成纳米颗粒，表征显示可接受稳定性和分布，9b稳定性最高（?33.20 mV）；纳米制剂中9b、9c、8c对革兰阳性E. faecalis、S. aureus和革兰阴性E. coli、P. aeruginosa表现优良至良好活性，9b最强且最广谱，抑菌圈最高达E. faecalis 15.31 mm、E. coli 13.20 mm，MIC 5.00 μg/mL（E. faecalis、E. coli、S. aureus）与环丙沙星相当或更优；9c和8c对E. coli MIC 5.00 μg/mL、对S. aureus 10.00 μg/mL，对革兰阴性菌有前景；9a完全无活性，11a和8a潜力低；纳米化较母体明显提高活性；对接和MD显示9b与DNA gyrase B结合，相关残基运动多于反相关，DCCM示结合引起内部结构变化；计算提示合理机制但仍需DNA gyrase抑制实验确认靶点结合；比较对接8c和9c提供结构决定因素；总体验证9b为最有前景的DNA gyrase B抑制剂候选，建议进一步药理研究并用于抗微生物伤口敷料等健康与制药领域。