迪纳里克喀斯特洞穴涡虫科（Planariidae）表现出不同水平的洞穴性状演化

《Ecology and Evolution》：Cave-Dwelling Planariidae in Dinaric Karst Exhibit Differing Levels of Cave Trait Evolution

　　

摘要 迪纳里克喀斯特（Dinaric karst）包含超过10,000个洞穴的网络，是全球最重要的地下生物多样性热点之一。该区域栖息着高度多样且通常特有的物种，包括涡虫纲扁形动物（planarian flatworms）。尽管洞穴涡虫在该地区早已被知晓，但尚未采用整合性方法进行研究，它们与地表近缘种的演化关系仍未解决。为填补这些空白，研究人员结合了野外采样、基于细胞色素氧化酶亚基I（COI）和18S核糖体RNA基因的系统发育分析以及表型鉴定。结果表明，迪纳里克喀斯特的洞穴涡虫科（Planariidae）至少属于三个属，其分布范围和多样性均比先前认知的更广。研究人员将迪纳里克喀斯特的洞穴记录从26处增加到37处，并在克罗地亚洞穴中首次记录了cf. Atrioplanaria和Phagocata。系统发育重建结果与独立的洞穴定殖事件一致，包括在Crenobia属和cf. Atrioplanaria属内的多次定殖。种群内部及种群间在色素沉着和眼睛退化方面的变异进一步揭示了洞穴相关表型的异质性演化轨迹。研究人员的分子系统发育和性状变异性记录，为建立涡虫科作为研究洞穴环境中色素丢失和眼睛退化趋同演化机制的模型迈出了第一步。

一、研究背景、问题与研究意义

迪纳里克喀斯特（Dinaric karst）沿亚得里亚海东海岸平行延伸，拥有超过一万个洞穴，是世界上研究最深入的地下区域之一，也是地下生物多样性最丰富的热点地区。然而，许多分类群的研究仍然不足，新物种和谱系不断被发现。由于兼具地上和地下的高生物多样性，该区域为研究物种形成、辐射适应、表型可塑性和趋同演化等进化过程提供了天然实验室。在趋同演化方面，虽然洞穴生物属于不同门类，但它们对洞穴环境的适应往往趋同于一套共享的穴居形态表型（troglomorphic phenotypes），其中最典型的是身体色素沉着和视觉结构的丧失。然而，洞穴相关性状趋同演化的机制仅在少数案例中得到阐明，主要集中在色素缺失上。

淡水涡虫（freshwater planarians）因其在迪纳里克喀斯特的地下和地表环境均有分布，并且易于进行色素生物合成和眼睛形成的机制研究，成为探究洞穴相关性状趋同演化的理想模型。但是，此类研究需要厘清地表与洞穴种群之间的系统发育关系，并以确定亲缘关系密切的洞穴和地表物种作为比较分析的理想起点。尽管对迪纳里克喀斯特涡虫的研究可追溯到20世纪初，但一直零散且不系统。此前仅报道了26个含有涡虫科（Planariidae）的地下地点，涉及9个种和1个变种。因此，对该地区洞穴涡虫的生物多样性及其演化关系缺乏系统性认识。

为填补上述空白，研究人员开展了本研究。研究的重要意义在于：首次对迪纳里克喀斯特的洞穴涡虫科进行了分子分析，揭示了比以往认知更高的生物多样性，发现了多个独立的洞穴定殖事件，并记录了洞穴相关性状的变异性，从而为将涡虫科确立为研究洞穴环境趋同演化机制的模型系统奠定了基础。

二、主要关键技术方法

1. 1.
   野外采样与样本来源：研究人员及其同事在克罗地亚生物洞穴学会过去三十年的广泛调查中，从11个洞穴地点（克罗地亚8个，波黑3个）和6个地表地点（克罗地亚5个，波黑1个）采集了样本。
2. 2.
   DNA提取与PCR扩增：对代表性样本进行DNA提取，并使用特异性引物分别扩增线粒体细胞色素氧化酶亚基I（COI）和核糖体18S rRNA基因片段。
3. 3.
   转录组序列提取：从公共数据库（Planmine）及研究团队未发表的洞穴涡虫转录组数据中，通过BLAST搜索提取同源的COI和18S序列以补充数据集。
4. 4.
   NCBI数据库检索：在NCBI核苷酸数据库中检索Crenobia、Phagocata和cf. Atrioplanaria属的相关COI和18S序列，并以Polycelis felina作为外群。
5. 5.
   系统发育树重建：共分析了72条序列，利用MAFFT进行多序列比对，并采用最大似然法（ML）和贝叶斯推断（BI）对串联的COI+18S数据集以及单个基因数据集进行系统发育树构建。

三、研究结果

3.1 系统发育关系

通过对来自11个洞穴和6个地表地点的淡水三肠目涡虫进行遗传分析，并结合外部形态和咽部数量，研究人员发现洞穴标本归属于三个谱系：cf. Atrioplanaria、Crenobia，以及包含Phagocata和Planaria的分支。贝叶斯推断（BI）分析表明，洞穴9号和Srf5号样本与欧洲Phagocata聚为一支，被归入Phagocata属。洞穴1号和4号样本与撒丁岛的地表种群聚为一支，被归入cf. Atrioplanaria。Crenobia属内包含来自8个洞穴和5个地表的样本，形成了四个有统计支持的洞穴谱系：洞穴5号处于所有其他Crenobia的姊妹位置；南方洞穴分支包含洞穴3、6、10、12号；洞穴7号与Crenobia montenigrina聚类；洞穴8号和11号则与韦莱比特山（Velebit Mountain）附近的地表种群聚为一支。

3.2 色素沉着与眼睛变异

研究发现，洞穴和地表的Phagocata均无色素但眼睛发育良好。两个cf. Atrioplanaria种群也无色素，其中洞穴4号的个体无眼，而洞穴1号的个体眼睛数量存在变异（0到2只）。在洞穴Crenobia中，早期分化的两支（洞穴5号和南方洞穴分支）同时缺乏色素和可见的眼睛；相反，洞穴7号的C. montenigrina和韦莱比特山分支的两个洞穴种群保留了发育良好的眼睛，但韦莱比特山分支显示出不同程度的身体色素沉着，甚至在同一个洞穴种群内部也存在显著变异。

3.3 Crenobia咽部数量的变异

研究人员进一步考察了咽部数量这一分类学特征。韦莱比特山分支的所有个体均为单咽，符合C. alpina的描述。其余标本均为多咽。洞穴7号的个体拥有超过10个咽部，与C. montenigrina的描述一致。洞穴5号和南方洞穴分支的大多数个体在外观上与已知的唯一专性洞穴Crenobia物种——C. anophthalma相似，但在咽部数量上存在差异：洞穴5号、3号和6号的个体最多有3个咽部，而洞穴10号的个体则有5到7个咽部。

四、讨论总结与研究结论

讨论总结： 研究人员的采样揭示了迪纳里克喀斯特洞穴中至少7个潜在的独立涡虫科谱系，首次在克罗地亚洞穴中记录了Phagocata属和cf. Atrioplanaria属，并将该区域的洞穴涡虫记录从26处大幅提升至37处，显著提高了对该地区地下涡虫多样性的认知。系统发育分析显示，cf. Atrioplanaria在克罗地亚姆列特岛（Mljet）和撒丁岛的种群在系统发育上更为接近，而非地理上更近的另一个克罗地亚种群，这暗示了复杂的古地理联系和独立的洞穴定殖事件。在Crenobia属内，研究识别出至少四个洞穴相关谱系，结合C. montenigrina和C. anophthalma的存在，支持了该属多次独立进入洞穴的假说。关于性状变异，Phagocata和cf. Atrioplanaria的无色素状态不能简单归因于洞穴适应，因为地表也有无色素的种类。cf. Atrioplanaria种群间和种群内眼睛数量的变异可能反映了不同的适应阶段或局部环境压力。Crenobia属内表现出的从完全穴居形态到保留色素和眼睛的梯度变异，以及韦莱比特山种群内显著的色素变异，可能源于放松的选择压力或近期洞穴定殖。这些发现也凸显了对Crenobia属进行整合分类学重新评估的必要性，尤其是其洞穴种群。

研究结论（翻译）： 我们的研究表明，迪纳里克喀斯特的洞穴涡虫科比以前所知的分布更广、多样性更高。新出现的系统发育和生物地理模式指向了一个复杂的演化历史，并强调了在该地区进行进一步研究的必要性，包括更广泛的分类学和地理学采样。新生成的基因序列，特别是针对Crenobia属的序列，为未来的DNA条形码、系统发育和整合分类学研究提供了宝贵的参考。纳入更多分子标记的分析，结合详细的分类学研究，对于解决涡虫科内部的亲缘关系和界定物种边界至关重要。最后，所提供的多次洞穴定殖事件的证据，以及洞穴定殖模式和洞穴相关性状变异的显现，突显了涡虫科作为一个有前景的比较系统的潜力，可用于研究地下环境中趋同演化背后的演化过程。