《Microbiological Research》：Correlation-guided discovery of non-canonical succinate producers from mixed culture fermentation
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琥珀酸水平与全长rRNA操纵子扩增子谱呈相关性。经相关性分析筛选出四个与琥珀酸高度相关的分类群并进行实验验证。所有四个分类群的近缘菌株在单培养条件下均能产生琥珀酸。L. gelidum和D. welbionis被新鉴定为琥珀酸产生菌。基于相关性的分析流程可在未
琥珀酸水平与全长rRNA操纵子扩增子谱呈相关性。经相关性分析筛选出四个与琥珀酸高度相关的分类群并进行实验验证。所有四个分类群的近缘菌株在单培养条件下均能产生琥珀酸。L. gelidum和D. welbionis被新鉴定为琥珀酸产生菌。基于相关性的分析流程可在未定义培养体系中优先筛选候选产生菌。
论文解读
一、研究背景与研究目的
理解微生物群落组成与生态系统功能之间的关系是微生物生态学的核心挑战之一。在厌氧生物反应器等工程化环境中，复杂微生物联合体通过代谢网络转化复杂底物，其产物产量既受群落结构影响，也受运行条件制约。混合培养发酵（MCF）利用群落层面的代谢能力，可实现复杂废弃物来源原料的资源化利用，无需无菌条件，并具备纯培养所不具备的稳健性和底物灵活性。
琥珀酸是一种具有重要工业价值的平台化合物，在制药和生物聚合物领域有广泛应用。然而，与MCF中通常占主导的短链或中链羧酸盐不同，琥珀酸很少作为主要终产物积累，更多是作为代谢中间体存在。目前其生物技术生产主要依赖在精制底物上生长的专门化或基因改造纯菌株，这限制了其与废弃物资源化场景的整合。
尽管已有多种方法可用于将特定分类群与代谢过程关联，如宏基因组学、宏转录组学和稳定同位素探针技术（SIP），但基于相关性的方法提供了一种互补策略。然而，短读长扩增子测序（如V3-V4高变区）常无法在物种水平区分分类群，而全长rRNA操纵子测序可捕获完整的16S-23S区域，提供跨多样群落成员的物种水平分辨率。此前仅有少数研究尝试将琥珀酸产生与特定群落成员关联，MCF中负责琥珀酸形成的具体群落成员在很大程度上仍未得到鉴定。
基于此，研究人员提出假设：在废弃物供给的生物反应器中，特定可识别的分类群对琥珀酸积累有贡献，其相对丰度与琥珀酸浓度相关，且这些分类群的近缘菌株在受控单培养条件下可产生琥珀酸。研究旨在鉴定具有琥珀酸产生能力的分类群，而非优化产物产量。
二、主要技术方法
研究人员利用先前MCF研究（Prusak et al., 2026）中两个以城市固体废弃物有机组分（OFMSW）为底物的连续运行反应器（R1为中温富集接种物，R2为高温富集接种物）的群落组成数据，该数据通过全长rRNA操纵子扩增子测序获得，共54个样本。采用中心对数比变换（CLR）处理原始序列计数以解决数据成分性问题，随后使用主成分分析（PCA）、偏最小二乘分析（PLS）及其判别分析版本（PLS-DA）将微生物组成与高琥珀酸浓度关联，模型经999次置换检验验证（p < 0.001）。根据相关性强度和文献支持筛选候选菌种，从DSMZ菌种保藏中心获取四个候选分类群的纯培养菌株，在多种培养基条件下进行批次培养实验，通过高效液相色谱（HPLC）测定底物和产物浓度。对未报道过琥珀酸产生能力的候选菌种进行公开基因组筛选，查找琥珀酸产生相关基因。
三、研究结果
3.1 琥珀酸产生潜在参与者的统计鉴定
在150天的采样期间，PCA揭示了两个反应器群落组成的明显时间模式。第一阶段（d0-d35），R1和R2的微生物群落最初趋同，与瞬时琥珀酸产生相吻合。第二阶段结束时（d49），群落分离主要由Acetivibrio物种和部分Clostridium物种驱动。第三阶段（d77）温度升至50°C后，群落以Thermoanaerobium和Weizmannia属为主，但未建立产琥珀酸的微生物群落。第四阶段（d96）恢复第一阶段运行条件后，群落相应恢复。第五至第七阶段（d114-d150），随着HRT逐步缩短和琥珀酸浓度升高，样本逐渐向图的右下象限移动。
PLS分析将高琥珀酸样本（>3 g/L）聚类在一起。PLS-DA载荷图和Pearson相关系数确定了11个可能驱动琥珀酸积累的分类群。基于相关性强度、文献证据和菌种可获得性，研究人员选择四个候选分类群进行实验验证：C. butyricum（两反应器Pearson相关系数最高，r = 0.82）、L. gelidum（r = 0.44）、D. welbionis（r = 0.39）和L. plantarum（排除接种物后r = 0.39）。其余分类群因文献支持不足被排除。
3.2 相关性分析的实验验证
在含OFMSW的矿物培养基（MM-W）中，C. butyricum是唯一瞬时产生琥珀酸的菌株，第3天达到峰值0.16 ± 0.02 mM，随后在第14天降至不可检测水平，这与琥珀酸在早期生长阶段作为额外电子汇的作用一致。其余菌株在此条件下未产生琥珀酸。
在DSMZ推荐培养基中培养21天后，所有受试菌株均产生琥珀酸——L. plantarum产生0.86 mM，L. gelidum和D. welbionis各产生0.60 mM。在完整DSMZ 11a培养基中培养28天后，三个菌株分别产生0.86 ± 0.04 mM、0.90 ± 0.00 mM和0.82 ± 0.06 mM的琥珀酸。
在改良MRS培养基（MRS-A和MRS-B，添加微量元素和NaHCO3，MRS-B另含酪蛋白氨基酸）中，L. plantarum在两种改良培养基中分别产生1.27 ± 0.01 mM和1.04 ± 0.06 mM琥珀酸，比未改良MRS提高48%。但L. gelidum和D. welbionis的琥珀酸产量未见显著提高。
基因组筛选显示，L. gelidum DSM 5578缺乏延胡索酸还原酶和延胡索酸水合酶，但编码琥珀酸半醛脱氢酶，可直接将琥珀酸半醛氧化为琥珀酸；D. welbionis DSM 106889缺乏延胡索酸还原酶和苹果酸脱氢酶，但编码氧化性TCA分支酶，可生成琥珀酰-CoA，但未鉴定到释放游离琥珀酸的酶。
四、讨论与结论
中温条件（37°C）和pH 6.5-7.0有利于反应器条件下琥珀酸产生，最高浓度与OLR增加和HRT缩短相吻合。较高的OLR提供过量碳源，过剩的还原当量有利于延胡索酸还原；较短的HRT可冲刷生长较慢的微生物，限制琥珀酸向其他代谢物（如丙酸）的进一步转化。
反应器供给的原料本身可能起重要作用。OFMSW水解产生复杂的糖类、氨基酸、肽和有机酸混合物，天冬氨酸和谷氨酸等氨基酸可直接进入C4库，绕过羧化步骤。群落其他成员释放的C4中间体（如延胡索酸、苹果酸或天冬氨酸）可被鉴定出的分类群还原为琥珀酸，而无需这些分类群自身从糖类产生琥珀酸。
四个受试菌株的自然生态位——L. plantarum来自盐水橄榄、L. gelidum来自冷藏肉类、C. butyricum来自猪肠道、D. welbionis来自人肠道——表明其琥珀酸产生能力可能高度依赖环境背景。L. plantarum具有不完全TCA循环，仅作为次要产物形成琥珀酸，其琥珀酸形成受羧化能力限制。Leuconostoc属因具有柠檬酸通透酶而被认为具有产琥珀酸能力，但L. gelidum此前未被报道为琥珀酸产生菌。D. welbionis也从未与琥珀酸合成相关联。
典型的琥珀酸产生菌（Actinobacillus、Basfia）在接种物和最终群落中均未检出，但琥珀酸仍被产生，表明生态学上不同的成员承担了这一角色。所选物种与MCF研究中与琥珀酸产生相关的Actinobacteriota门在系统发育上无关，提示这些系统中琥珀酸合成可能由功能冗余但系统发育距离较远的分类群驱动。
研究结论：相关性分析鉴定了两个具有文献记载的琥珀酸形成能力的分类群（L. plantarum、C. butyricum）和两个此前未报道可产生琥珀酸的分类群（L. gelidum、D. welbionis）的序列。四个受试菌株均在单培养条件下产生琥珀酸，尽管滴度较低，与这些微生物有限的天然能力一致。这些结果表明，MCF中的琥珀酸产生不限于高产专家，而是分布在多个分类群中，每个贡献适度，群落可能提供其部分代谢途径在单培养中无法生成的前体。该研究为基于相关性的候选菌鉴定流程提供了概念验证。未来工作应在共培养或定义合成群落中检验这些分类群或直接从群落中分离的菌株，以评估其在MCF代表性条件下对琥珀酸合成的贡献，特别是补充缺失前体是否能提高基因组仅编码部分途径的菌株的产量。
