《The FASEB Journal》：Prepartum Heat Stress Dysregulates Immune Resilience in Postpartum Dairy Cows
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摘要专业翻译
全球气温持续升高对动物福利构成重大挑战，热应激可诱导疾病发生率上升。免疫韧性（immune resilience）对维持动物健康至关重要，然而热应激与免疫功能障碍及疾病之间的关联机制尚不明确。研究人员假设产前热应激会在奶牛产后不再处于热应激状态时
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全球气温持续升高对动物福利构成重大挑战，热应激可诱导疾病发生率上升。免疫韧性（immune resilience）对维持动物健康至关重要，然而热应激与免疫功能障碍及疾病之间的关联机制尚不明确。研究人员假设产前热应激会在奶牛产后不再处于热应激状态时，仍持续破坏其免疫韧性。在夏季，将非泌乳期妊娠奶牛于妊娠最后46天分别置于产前降温（风扇、喷淋和遮荫；n=31）或热应激（仅遮荫；n=31）条件下。分娩后，所有奶牛均接受降温处理。研究人员在产后21天内评估了产后健康状况、外周血及子宫内膜样本。与降温组奶牛相比，产前热应激提高了产后疾病的发生率，但对子宫微生物组影响甚微。产前热应激增加了产后白细胞计数（white blood cell count）和平均血小板体积（mean platelet volume），而脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激下全血中CXCL8、IL1B和TNF的表达趋于减弱。值得注意的是，产前热应激增强了全血中脂多糖刺激的IL-6和IL-8分泌。与此同时，产前热应激诱导了产后子宫内膜转录组中与免疫通路相关的轻度但持续的改变。此外，产前热应激减弱了培养的子宫内膜细胞中CXCL8、IL6和TNF的基础表达。综上所述，这些研究结果表明，产前热应激在不依赖微生物组变化的情况下，增加了产后疾病发生率并破坏了外周及子宫内膜的免疫韧性。
论文解读
一、研究背景与目的
随着全球气候变暖的加剧，环境温度持续升高对畜牧生产与动物福利构成重大挑战。奶牛因高泌乳性能的遗传选育而具有较高的采食量、代谢产热和总热负荷，对热应激尤为敏感。热应激不仅造成美国奶牛业每年17亿至24亿美元的经济损失，还通过损害免疫细胞功能和抗体合成削弱免疫韧性，增加感染易感性。然而，热应激诱导免疫功能障碍进而增加疾病发生率的潜在机制仍不清楚。
围产期是奶牛疾病高发的关键窗口期。泌乳奶牛通常配备喷淋和风扇等降温设施，但产前非泌乳奶牛常饲养于缺乏热应激缓解措施的牧场或设施中，因而暴露于产前热应激。已有研究表明，即使在产后提供降温，产前热应激仍会增加产后子宫疾病的发生率和持续性。值得注意的是，产前热应激导致的子宫疾病风险升高并未伴随阴道细菌载量的增加，提示宿主免疫受损可能是疾病发生的主要原因。然而，产前热应激如何长期改变宿主免疫韧性，目前尚不清楚。
基于此，本研究旨在阐明产前热应激在奶牛产后恢复降温条件后，对外周血和子宫内膜细胞免疫功能的长效影响。研究人员假设产前热应激通过诱导外周和子宫内膜免疫反应的持续性改变，损害产后免疫韧性，从而增加疾病易感性。
二、研究设计与主要技术方法
本研究于2023年和2024年夏季在美国佛罗里达大学奶牛研究单元开展，共纳入62头妊娠荷斯坦奶牛（胎次1–4）。奶牛按妊娠天数和预期传递能力排序后，采用随机完全区组设计分为两组：降温组（n=31）配备风扇、喷淋和遮荫；热应激组（n=31）仅提供遮荫和自然通风。产前处理持续妊娠最后46天，分娩后所有奶牛均置于统一降温环境。
研究采用的主要技术方法包括：环境温湿度指数（temperature-humidity index, THI）持续监测及直肠温度和呼吸频率测定；产后血液学分析采用自动血液分析仪；全血离体脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激试验评估外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）炎症反应；16S rRNA基因V4区扩增子测序（Illumina MiSeq平台）结合QIIME2流程分析子宫微生物组；子宫内膜细胞采用细胞刷采集后进行原代培养；RNA测序（Illumina NovaSeq X Plus平台）结合DESeq2分析子宫内膜转录组；实时荧光定量RT-PCR检测炎症介质基因表达；ELISA定量血浆及培养上清中IL-6、IL-8、MIP-1α和TNF-α蛋白浓度；Ingenuity Pathway Analysis（IPA）进行通路和上游调控因子分析。
三、研究结果
3.1 产前热应激对产前及产后生理参数的影响
产前热应激显著提高了产前直肠温度（39.15°C vs. 38.80°C）和呼吸频率（76.2 vs. 60.6次/分钟）。产后，热应激组奶牛总体发病率显著高于降温组（41.8% vs. 16.1%），但子宫疾病发生率两组间无显著差异。产前热应激不影响产后直肠温度、体况评分和阴道黏液评分。子宫内膜多形核（polymorphonuclear, PMN）细胞比例不受产前热应激影响，但在无子宫疾病奶牛中，产后第7天热应激组PMN比例有高于降温组的趋势。
3.2 产前热应激改变产后血液学指标及脂多糖诱导的外周血炎症反应
产前热应激奶牛产后白细胞计数显著升高，平均血小板体积也显著增加。红细胞、血红蛋白、血细胞比容、红细胞压积、平均红细胞血红蛋白浓度、平均红细胞血红蛋白和血小板计数均随产后天数增加而下降，且热应激与天数之间存在显著交互作用。在离体脂多糖刺激试验中，脂多糖显著上调CXCL8、IL1B、IL6和TNF的mRNA表达，但产前热应激趋于降低CXCL8、IL1B和TNF的表达。在蛋白水平，产前热应激显著增加了脂多糖刺激后IL-6和IL-8的分泌量。
3.3 产前热应激不改变产后子宫微生物组组成和多样性
子宫微生物组的α多样性（ASV、Chao1和Shannon指数）和β多样性在降温组与热应激组之间均无显著差异，门水平和属水平的相对细菌丰度也未受产前热应激影响。作为对照验证，患有子宫疾病的奶牛α多样性降低、β多样性改变，且Fusobacterium丰度显著升高，证实了分析体系的有效性。
3.4 产前热应激诱导产后子宫内膜转录组的细微改变
共鉴定出40个差异表达基因（FDR≤0.1，log2倍数变化≥|1|），其中27个上调、13个下调。上调最显著的基因包括LOC112442666、BATF3、CD47、GPR84和PLEK；下调最显著的包括LOC112441463、GALNT15、LOC104968484、THBS4和LOC112445719。通路分析显示87条典型通路受影响，最显著富集的通路包括粒细胞黏附与渗出、流感发病机制中高细胞因子/高趋化因子作用、粒细胞缺乏性黏附与渗出、血肿消退信号通路及模式识别受体在细菌和病毒识别中的作用。上游调控因子分析预测IFNγ、IL-1β、TNF、RIG-I、IL-2和STAT1被激活，而TREX1和COPA被抑制。
3.5 产前热应激对子宫内膜上皮细胞活力和脂多糖诱导炎症介质表达的影响
免疫细胞化学证实培养细胞中94.2%为细胞角蛋白-18阳性的上皮细胞。产前热应激、脂多糖和体外热休克均不影响细胞活力。在热中性条件下，脂多糖显著上调CXCL8、IL1A、IL1B、IL6、TNF、PTGS2和TLR4表达，但产前热应激减弱了CXCL8、IL6和TNF的基础表达。热应激×脂多糖×胎次的显著三向交互作用表明，产前热应激对脂多糖反应的影响受胎次调节。
3.6 急性热休克改变产前热应激奶牛子宫内膜上皮细胞的脂多糖反应
体外热休克（40.0°C）单独降低了PTGS2和IL6的表达，并趋于降低CXCL8表达，提示急性高温降低基础炎症状态。来自产前热应激奶牛的细胞在热休克条件下表现出更强的HSPA1A热休克反应，且热应激×热休克对HSPA1A存在显著交互作用，表明产前热应激的残余效应。
四、讨论与结论
本研究证实，产前热应激在奶牛产后恢复降温条件后，仍持续增加疾病发生率并破坏外周和子宫内膜免疫韧性，且这一效应独立于子宫微生物组的变化。产前热应激奶牛产后白细胞计数升高，脂多糖诱导的促炎基因表达趋于减弱，但IL-6和IL-8蛋白合成增加，这种mRNA与蛋白水平的不一致可能源于免疫细胞数量的代偿性增加或转录后调控机制。子宫内膜转录组显示与免疫通路相关的轻度但持续性改变，上游调控因子预测IFNγ、TNF和IL-1β信号通路激活，提示产前热应激可能通过干扰干扰素和炎症信号通路重塑子宫局部免疫状态。体外实验进一步表明，产前热应激奶牛来源的子宫内膜上皮细胞表现出减弱的基础炎症基因表达和增强的热休克反应，提示局部免疫韧性受损。本研究的重要贡献在于：在统一的产后热中性条件下评估免疫反应，排除了持续热应激的混杂效应，从而确证了产前热应激对产后免疫功能的长期编程效应。这些发现为理解热应激与产后疾病之间的因果机制提供了新证据，提示产前热应激通过损害宿主免疫韧性而非增加病原载量来促进疾病发生，为奶牛围产期热应激管理策略的优化提供了科学依据。
