《Molecular & Cellular Proteomics》：Spatial Proteomics Uncovers Immune Cell Neighborhoods and Tumor-Immune Interfaces in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma
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胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）仍是最致命的恶性肿瘤之一，预后极差且治疗选择有限。肿瘤细胞与其微环境之间的复杂相互作用显著导致治疗抵抗，然而技术挑战阻碍了对PDAC组织中免疫组分的全面空间表征。本研究
胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）仍是最致命的恶性肿瘤之一，预后极差且治疗选择有限。肿瘤细胞与其微环境之间的复杂相互作用显著导致治疗抵抗，然而技术挑战阻碍了对PDAC组织中免疫组分的全面空间表征。本研究采用多重离子束成像（multiplexed ion beam imaging, MIBI）进行高维空间蛋白质组学分析，定量检测了12例接受后续辅助化疗的初治PDAC患者组织中的27种蛋白标志物。研究人员通过基于深度学习的细胞分割和专家验证的表型注释，实现了PDAC生态系统的高置信度单细胞表型图谱构建。分析结果显示，在最终经历疾病复发的患者中，免疫抑制性髓系细胞群显著富集；相反，细胞毒性CD8+ T细胞在这些易复发肿瘤中呈现耗竭状态。利用空间概率主题建模，研究人员鉴定了八种具有独特组成和功能状态的细胞邻域（cellular neighborhoods），其中包括在复发患者中富集的免疫抑制性邻域。尽管免疫原性细胞邻域在两类患者群体中均存在，但对肿瘤-免疫邻域的分析显示功能标志物表达谱发生改变，提示复发与未复发患者之间存在不同的免疫激活状态。本研究提供了PDAC免疫景观的高分辨率空间图谱，并鉴定了具有预后意义的微环境特征，可能为这种难治性疾病的创新免疫治疗策略开发提供参考。
胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）是最常见的胰腺癌类型，五年生存率低于10%，通常采用姑息性化疗。尽管免疫治疗已在多种癌症中取得成功，但抗PD-1和抗CTLA-4疗法在PDAC中迄今几乎未见获益。这种无应答最初提示PDAC肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中免疫浸润有限；然而，越来越多的证据表明这些肿瘤内存在显著的免疫细胞浸润，促使研究者加强对这些细胞群体的表征以开发更有效的治疗策略。
研究团队（包括本课题组）以往致力于表征免疫浸润，证明了切除标本中浸润淋巴细胞的数量可决定预后。在肿瘤浸润淋巴细胞中，研究人员观察到部分CD8 T细胞耗竭有限，且大多数CD8和CD4 T细胞处于衰老状态。此外，研究人员发现活化的调节性T细胞（regulatory T cells, Tregs）表达多种检查点分子（包括TIGIT、ICOS、CTLA4和CD39），提示存在免疫抑制性微环境。近年单细胞免疫图谱研究进一步揭示了PDAC中浸润免疫细胞的复杂性，但大多缺乏理解细胞间复杂相互作用所需的空间背景。免疫细胞相对于肿瘤细胞和基质成分的空间组织对其功能具有深远影响，靠近肿瘤细胞、被纤维化屏障排斥以及形成三级淋巴结构均可能影响治疗应答。此外，同一肿瘤内可能共存不同的免疫微环境，形成区域异质性，这是批量或单细胞方法无法捕获的。为解决这些关键知识缺口，研究人员采用多重离子束成像（MIBI）同时可视化PDAC组织中的27种蛋白标志物，从而实现免疫细胞表型、功能状态及其与临床结局关系的全面空间映射。
在人组织获取与患者知情同意方面，接受根治性切除的PDAC患者被纳入研究。8名患者来自牛津（Oxford Radcliffe生物库，项目编号19/A177），4名患者来自亚琛医学中心（RWTH Aachen生物库，项目编号EK360/19）。所有肿瘤均为手术切除的原发性PDAC，并制成福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE）组织块。所有肿瘤在分析前均经两位专家病理学家进行病理复核和组织学确认。研究严格遵守所有机构伦理规定，所有患者均签署知情同意书。
在MIBI抗体偶联与panel设计方面，使用Maxpar X8多金属标记试剂盒和Ionpath偶联试剂盒完成抗体偶联。MIBI panel包含靶向PDAC特异性标志物、基质成分和免疫细胞标志物的抗体，以全面分析胰腺肿瘤微环境。组织染色方面，FFPE切片厚度4 μm，经烤片、抗原修复、封闭后，与偶联抗体混合物4°C孵育过夜，随后洗涤、后固定、梯度脱水并真空干燥保存。
MIBI图像采集与预处理使用商用MIBIscope?系统。由于MIBI可获取的视野（field of view, FOV）面积有限，由认证病理学家（L.R.H.）从连续H&E切片中选取具有病理学意义的FOV（聚焦肿瘤和免疫浸润区域）。原始.bin文件经toffy包（v0.2.2）提取单通道质谱图像，使用自定义MatLab脚本进行图像拼接和平场校正，并利用toffy执行Rosetta图像补偿以去除背景噪声。
单细胞分割与表达矩阵提取使用Mesmer（v0.12.2），以组蛋白H3作为细胞核通道，HLA-DR、CD45-RA、CD3、CD20、CD68之和作为膜通道。每个分割细胞区域内所有标志物的信号求和并除以细胞大小进行归一化，生成最终细胞表达矩阵（每行代表单个细胞，每列代表大小归一化的标志物表达水平）。随后对每个标志物进行0.5%至99.5%的分位数截断，并将最终表达缩放至0-1。
细胞类型注释、聚类与邻域建模方面，使用PhenoGraph（v0.99.1）识别初始细胞聚类，根据典型表型标志物表达手动分配推定细胞类型身份，并通过将表型映射回多重MIBI图像进行视觉验证。必要时进行迭代亚聚类。最终肿瘤细胞群在认证病理学家指导下与正常上皮细胞群区分。细胞邻域使用Spatial-LDA（参数admm_rho=0.1）跨组织区域识别，通过测试邻域数n∈{6,7,8,10,11}，最终确定n=8为具有最大分辨率和可读性的最优邻域数。细胞邻域边界处的细胞通过Delaunay三角剖分（deldir 2.0.4）确定。
癌症缓冲区分区分析中，将mix_keratin MIBI图像二值化、形态学变换和尺寸过滤生成上皮斑块图像，再结合病理学家指导的肿瘤注释生成肿瘤斑块图。随后计算每个FOV中每个细胞到最近肿瘤斑块的距离，并按距离分箱进行可视化。
统计建模方面，为全面了解中性粒细胞功能特征对患者应答（复发vs.未复发）的影响及其与中性粒细胞空间位置（近肿瘤或远肿瘤）的交互作用，研究人员实施了基于主成分分析（principal component analysis, PCA）和随机森林的建模方法，采用10次重复3折交叉验证，每折按患者水平分层。中性粒细胞首先分为“近肿瘤”（距最近肿瘤区域≤25 μm）和“远肿瘤”（>25 μm且≤100 μm）。对每组的功能特征谱（CD16、MPO、CD45RA、CD45RO、HLA-DR、Ki-67、PD-L1）进行PCA，得到两组主成分，然后用这些主成分拟合以复发状态为响应变量的随机森林模型。记录各模型的特征重要性指标，根据主成分在模型中进入前5位最重要变量的频率进行排序，随后检查前几位主成分的载荷以确定其生物学解释。
功效计算方面，为识别与复发相关的差异，研究人员量化每个FOV或非重叠子FOV内每种细胞类型和细胞邻域（cellular neighborhood, CN）的相对丰度。对于每个子FOV，将某种细胞类型或CN的细胞计数除以该子FOV的总细胞数得到比例，然后在复发组和未复发组之间使用双侧Wilcoxon秩和检验比较这些比例（α=0.05），倍数差异以两组平均比例之间log2转换比值表示。为评估有限样本量下发现的稳健性，研究人员进行了基于经验模拟的功效分析：在200次迭代中，从复发组和未复发组随机丢弃相等数量的非重叠子FOV，每次迭代重复Wilcoxon检验。这种分层子采样策略允许估计在一系列减样场景下检测到显著差异（p<0.05）的经验概率，经验功效总结为保留显著性的迭代比例，并使用二项估计计算95%置信区间。持续高经验功效（≥80%）表明观察到的复发相关细胞和空间特征具有可重复性，并非过度拟合所致。
研究结果部分，首先通过空间免疫谱分析揭示了胰腺癌中独特的免疫特征。为阐明驱动治疗抵抗和疾病复发的关键免疫决定因素，研究人员开展了一项对12例初治PDAC患者的前瞻性研究，这些患者随后均接受了辅助化疗。分析时，8例患者已出现癌症复发，4例患者保持无复发，为识别与临床结局相关的治疗前免疫特征提供了难得机会。研究采用含27种标志物的MIBI panel，涵盖关键淋巴系、髓系和基质表型标志物以及指示细胞活化和耗竭状态的功能标志物。通过将MIBI与先进单细胞分割和注释算法相结合，研究人员能够在保留组织架构内解析不同细胞表型及其空间关系，共获取39幅多重图像。
在复发胰腺肿瘤富集免疫抑制性髓系细胞群方面，研究人员对所有组织样本的细胞标志物表达谱进行无监督聚类，鉴定出16种不同细胞群，包括多种T细胞亚群、B细胞、具有多种表型状态的巨噬细胞以及非免疫基质和上皮成分。聚类结果清晰区分淋巴系和髓系谱系，同时捕获这些主要谱系内的功能异质性。比较复发与未复发患者样本时，观察到复发组中免疫抑制性髓系细胞群显著富集：M2样抗炎表型巨噬细胞和正常上皮细胞群在复发患者初治样本中富集最显著，单核细胞也呈现富集，提示易复发肿瘤中存在广泛的免疫抑制性微环境。相反，细胞毒性CD8
+ T细胞在复发组治疗前显著耗竭，表明这些患者的抗肿瘤免疫受损。这些细胞组成差异在个体患者中一致观察到，支持免疫抑制特征作为治疗应答潜在决定因素的稳健性。
鉴于样本量相对较小，研究人员实施了基于模拟的经验功效分析以评估表型差异的可重复性。将每个FOV划分为20个非重叠子FOV以增加统计独立采样单元数量，同时避免伪重复。在每次迭代中从复发组和未复发组随机丢弃相等数量的子FOV（每次丢弃水平200次迭代），对每种细胞类型重新计算Wilcoxon秩和检验，经验功效定义为p<0.05的迭代比例。结果显示，若干免疫和上皮细胞群即使随机子采样后仍保持≥80%统计功效，中性粒细胞在每组丢弃100~150个子FOV后仍保持高经验功效，CD4 T细胞、CD8 T细胞、上皮细胞、淋巴管细胞、M2样巨噬细胞、单核细胞和浆母细胞也观察到类似稳定性，共同支持复发相关免疫特征的生物学稳健性。
在空间组织揭示与患者复发相关的免疫抑制邻域方面，研究人员采用概率主题建模方法定义组织多细胞结构，即“细胞邻域”。无监督分析鉴定出八种不同的邻域类型，每种具有独特的细胞组成和空间排列。这些邻域内的标志物表达分析揭示了超越单个细胞类型的协调免疫调节模式。研究人员鉴定出一种以M2样巨噬细胞和单核细胞共定位为特征的“免疫抑制”邻域，以及一种以正常上皮细胞伴Ki67表达为主导的邻域（提示潜在异常增殖）。两种邻域类型均在复发阳性患者中显著富集，可能促进肿瘤发生和复发。为进一步表征肿瘤-免疫相互作用，研究人员构建欧氏距离矩阵测量肿瘤邻域内细胞与其他邻域类型细胞之间的邻近性，并采用Delaunay三角剖分量化直接与不同邻域类型细胞接触的肿瘤邻域细胞比例。在未复发患者中，“活跃免疫”和“免疫丰富”邻域与肿瘤区域构成最频繁的相互作用。对肿瘤-免疫界面细胞功能标志物谱的分析发现免疫检查点和活化标志物的差异表达：在“活跃免疫”界面，细胞群表达较低水平的CD11b、CD15、CD16髓系标志物以及CD45RO、HLA-DR、MPO免疫活化标志物，提示尽管表型相似但存在功能独特且可能具有免疫抑制性的细胞状态。
在肿瘤缓冲区分区分析揭示与疾病复发相关的免疫细胞空间分布和中性粒细胞功能特征方面，研究人员通过结合角蛋白染色和病理学家注释的肿瘤区域生成每个FOV的肿瘤掩膜，计算每个细胞到肿瘤区域的最小距离，然后按距离分箱细胞表型比例并按患者复发状态绘图。结果显示复发和非复发患者肿瘤区域周围的免疫细胞组成存在显著差异。中性粒细胞是两组患者肿瘤区域附近最丰富且分布差异最大的细胞类型，但分布模式和功能特征不同：复发患者在中性粒细胞紧邻肿瘤边界处出现集中区域，而非复发患者在远离肿瘤界面（>25 μm）处中性粒细胞存在增加。中性粒细胞中CD15表达在两组间无显著差异，但功能标志物差异显著：复发患者中性粒细胞PD-L1和MPO表达显著升高，CD45RO表达降低。表达PD-L1的肿瘤相关中性粒细胞（tumor-associated neutrophils, TANs）通常被认为通过抑制细胞毒性T细胞而促肿瘤。这些功能差异与已知TAN特征一致，提示与疾病结局相关的不同中性粒细胞表型。虽然按肿瘤邻近度分组的中性粒细胞群体也表现出功能差异，但复发组之间的对比更为明显，表明在这种背景下，肿瘤相关中性粒细胞的功能状态比空间组织更能预测临床结局。
为进一步探索中性粒细胞与患者复发状态的关联，研究人员使用肿瘤相关中性粒细胞特征训练随机森林模型。鉴于样本量有限（n=12），首先应用PCA降维，分析包含“近”（距肿瘤边界≤25 μm）和“远”（>25 μm且≤100 μm）中性粒细胞群体的特征。模型显示“近”中性粒细胞群体特征对复发的贡献比“远”群体更显著。通过整合PCA载荷矩阵和偏依赖关系，研究人员确定了至少两种与PDAC患者结局密切相关的独特中性粒细胞相关特征：群体4和群体7表现出不同的PD-L1相关模式，分别与CD45RO和CD16的关系不同。尽管群体2观察到非单调关联，这些发现表明不同的多变量中性粒细胞特征可能捕获与复发预测相关的互补信息。基于抗体的成像空间蛋白质组学方法测量的特征数低于scRNA-seq等方法，且肿瘤中性粒细胞亚群通常基于scRNA-seq聚类定义而缺乏明确经验验证，因此难以建立严格相关性。但群体4中PD-L1水平升高提示其与免疫抑制性TAN群体（或“N2”状态）相关，其在治疗前的存在可能增强PD-1/PD-L1免疫抑制轴，导致抗肿瘤T细胞应答受抑而驱动潜在复发。另一方面，CD16表达标志中性粒细胞成熟，高CD16表达且PD-L1低表达的TAN在未复发患者治疗前更富集。这些发现进一步强调PDAC患者中TAN的异质性，并提示肿瘤-免疫界面中性粒细胞功能极化与PDAC治疗应答和疾病进展的潜在关联。
讨论部分总结了空间蛋白质组学分析揭示了PDAC复杂肿瘤微环境的见解，可能解释对常规疗法和免疫治疗方法应答不佳的原因。通过将高维蛋白表达数据与单细胞分辨率的空间信息整合，研究人员鉴定了与辅助化疗后疾病复发相关的独特细胞邻域和免疫细胞功能状态。关键发现是复发患者中免疫抑制性髓系细胞群的进一步富集，M2样巨噬细胞和特定单核细胞群体的丰度提示协调的免疫抑制程序可能促进肿瘤逃避免疫监视。中性粒细胞在肿瘤-免疫界面的表型异质性尤为显著：复发与未复发患者中性粒细胞的不同功能特征谱（PD-L1、MPO、CD45RO、CD16差异表达）指向这些细胞的极化可能决定疾病结局。空间分析揭示的细胞邻域显示不同组成和功能状态反映了免疫参与差异，提示复发与抗肿瘤免疫功能减弱相关，尽管存在表型相似且“活跃”的邻域结构，这合理化了将空间背景和细胞特征纳入PDAC治疗应答预测模型的必要性。
临床意义方面，首先，与疾病复发相关的细胞邻域识别为风险分层提供了潜在生物标志物；具有高免疫抑制髓系细胞浸润（尤其是特定中性粒细胞表型）的患者可能受益于更积极的治疗或更密切监测。其次，髓系群体的功能异质性提示潜在的干预靶点，将免疫抑制性髓系细胞重编程为促炎表型或选择性耗竭特定亚群可能增强常规化疗或免疫治疗疗效。
局限性方面，相对较小的样本量虽然提供了统计学显著结果并通过功效计算验证，但鉴于PDAC异质性，研究结论的稳健性可能受损，需要更大独立队列的未来验证。此外，分析未包含癌症相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs），尽管它们是PDAC TME的关键组成部分；SMA（公认CAF标志物）水平升高可稳健观察到，但缺乏清晰单一谱系标志物以及分割注释困难导致CAFs被归入“其他”细胞表型类别。多重成像方法虽提供了PDAC微环境细节，但未来将这些发现与基因组改变和全身免疫参数整合可提供更全面的治疗应答决定因素理解。
未来方向包括探索驱动PDAC中独特细胞邻域形成的机制，以及研究这些空间模式在治疗过程中是否动态变化。治疗前后的纵向采样可提供关于细胞邻域在疾病进展和治疗抵抗过程中如何演变的见解。此外，亟需功能研究以确定靶向特定细胞邻域能否增强治疗效力。
研究结论为：PDAC的空间蛋白质组学分析揭示了肿瘤和免疫细胞的复杂生态系统，其组织和功能状态与疾病复发相关。特定细胞邻域和髓系细胞表型的识别为治疗抵抗机制提供了新见解，并为治疗干预提供了潜在途径。肿瘤边界附近中性粒细胞亚群与疾病结局的潜在关联进一步强调了在理解癌症生物学中考虑空间背景的重要性，并凸显了空间蛋白质组学作为剖析PDAC及其他癌症类型肿瘤微环境的有力方法。
