《Molecular & Cellular Proteomics》：Simplifying low-input archival formalin-fixed paraffin-embedded proteomics: a detergent-free workflow in archival kidney tissue
编辑推荐：
中文摘要翻译
存档福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织是最大的临床注释人类生物样本资源，然而对低投入量显微切割区域进行蛋白质组学分析仍受到限制。研究人员开发了一种简化的工作流程，利用标准实验室基础设施，能够从激光显微切割的存档FFPE肾组织中实现深度蛋白质组
中文摘要翻译
存档福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织是最大的临床注释人类生物样本资源，然而对低投入量显微切割区域进行蛋白质组学分析仍受到限制。研究人员开发了一种简化的工作流程，利用标准实验室基础设施，能够从激光显微切割的存档FFPE肾组织中实现深度蛋白质组覆盖。研究人员系统性比较了以正十二烷基-β-D-麦芽糖苷提取后接单管固相增强样品制备（DDM+SP3）、无去污剂的三乙基碳酸氢铵提取后接SP3净化（TEAB+SP3）、以及无离线磁珠净化的直接TEAB处理三种方案。在所评估的实验条件下，去除去污剂净化步骤与低投入量FFPE样品中蛋白质组深度增加相关。直接TEAB工作流程可从存档十年以上的活检组织中27000 μm2的显微切割区域稳定鉴定多达5500种蛋白质。疏水性分析和功能富集分析显示，各工作流程间的理化性质及细胞区室覆盖高度相似，在所评估条件下未发现明显的工作流程相关偏倚。尽管因液相色谱-串联质谱（LC-MS）配置差异而未进行直接对照，各平台间观察到可比的蛋白质组覆盖度。所需投入量对应于常见的显微解剖单元，且不依赖自动化或专用微流控技术。该工作流程为肾组织区室分辨蛋白质组学提供了可行的框架，使基于长期FFPE样本库的回顾性及罕见病蛋白质组学研究成为可能。该工作流程在其他稀缺存档标本中的适用性仍需进一步研究加以评估。
论文解读
**一、研究背景与科学问题**
蛋白质组学能够直接表征细胞功能，包括基因组数据无法推断的蛋白质丰度与相互作用网络。高分辨率液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）与生物信息学的发展推动了疾病诊断、预后及进展的病理生理学理解。然而，福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织的蛋白质提取在技术上仍具挑战性，尤其在可用材料稀缺时更为突出。FFPE是临床标本的标准保存方法，能够长期储存并维持组织形态；但甲醛诱导的蛋白质交联、石蜡包埋、储存条件差异以及活检标本体积过小均限制了蛋白质回收率与检测灵敏度。激光显微切割（LCM）能够从FFPE切片中精确分离特定显微解剖区域，减少组织异质性，但同时也使投入材料量大幅降低至数千个细胞以下。低投入量样品在提取过程中极易发生技术性损失，尤其是涉及多次管转移、去污剂去除或复杂纯化步骤的工作流程。尽管自动化单细胞蛋白质组学平台可以缓解上述限制，但许多实验室难以获得此类设备。因此，亟需针对低投入量、LCM来源FFPE样品开发优化提取策略。已有的大多数深度蛋白质组覆盖方法依赖自动化平台、新鲜固定材料或大幅增加组织投入量，这限制了以存档人类FFPE活检标本为主要工作对象且缺乏专用微流控仪器的实验室及生物样本库对该类方法的采用。研究人员在此项工作中评估了一种针对激光显微切割存档FFPE组织的无去污剂提取框架，探讨了提取化学原理与磁珠净化对蛋白质组回收的影响，并比较了不同独立数据集和分析平台上的去污剂辅助与无去污剂工作流程。
**二、研究内容与主要结论**
研究人员以成人微小病变型肾病（MCD）患者的存档FFPE肾穿刺活检标本为材料（标本存档时间10至14年），开展了两项序贯实验。实验1纳入6例患者（n=6），评估了两种显微切割面积（27000 μm2和54000 μm2）及两种裂解缓冲液——三乙基碳酸氢铵（TEAB，20 mM，pH 8.2–8.6）和正十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM，0.015%），均经SP3净化处理。实验2纳入8例患者（n=8），在固定27000 μm2投入量下比较了TEAB+SP3完整工作流程与无SP3净化的直接TEAB提取。研究结果表明，在所评估条件下，去除去污剂净化步骤与蛋白质组深度增加相关。直接TEAB工作流程可稳定地从27000 μm2显微切割区域（对应肾小管等常见显微解剖单元）中鉴定多达5500种蛋白质，且不依赖自动化或专用微流控设备。该工作流程为肾组织区室分辨蛋白质组学提供了可及的实验框架，为长期FFPE样本库的回顾性及罕见病蛋白质组学研究奠定了基础。
**三、关键技术方法**
研究人员使用了以下主要技术方法：（1）激光显微切割（LCM）：从10 μm厚、经苏木精-伊红染色的PEN膜切片上显微切割肾小管区域（无硬化或纤维化），投入面积为27000 μm2或54000 μm2；（2）蛋白质提取策略比较：系统比较DDM+SP3、TEAB+SP3与直接TEAB三种方案，其中直接TEAB指省略离线磁珠净化步骤；（3）液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）：实验1采用Dionex Ultimate 3000 RSLCnano系统耦联Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪（FAIMS于?45 V补偿电压，DIA模式），实验2采用Evosep One系统耦联Orbitrap Exploris 480质谱仪（Whisper 20 samples/天梯度，DIA模式）；（4）生物信息学与统计分析：Spectronaut（v19.9）进行DIA数据处理，Perseus进行标准化与过滤，R（v4.3.2）进行统计分析与可视化，包括韦尔奇t检验、Wilcoxon秩和检验（Benjamini–Hochberg校正）、Pearson相关分析、主成分分析（PCA）、GRAVY疏水性评分及基因本体（GO）细胞组分富集分析。样本队列来源于挪威Region Ethics Committee（REK-Vest 2013/553）批准的成人MCD患者FFPE肾活检标本。
**四、研究结果**
**缺失率与检测行为：**在两项实验中，不同工作流程的缺失值分布存在差异。实验1中，DDM提取在低投入量（27000 μm2）下缺失值比例最高，TEAB相关工作流程缺失值持续较低；实验2中，直接TEAB方案的缺失值数量低于TEAB+SP3组合。低强度蛋白质的检测频率较低，且各工作流程间的差异在低强度范围内更为明显。
**蛋白质回收与蛋白质组覆盖：**实验1中，DDM处理的27000 μm2样品鉴定蛋白质中位数为2365种，54000 μm2为4732种，投入量对蛋白质回收有显著影响（p=0.0021）；TEAB+SP3在两种投入量间无显著差异，27000 μm2中位数为4726种，54000 μm2为4976种。实验2中，直接TEAB提取显著优于TEAB+SP3（p=2.49×10??），直接TEAB中位数达5565种蛋白质（范围5480–5728），而TEAB+SP3仅为3168.5种（范围240–4978）。基于TEAB的工作流程在蛋白质重叠分析中共享比例更高，表明其覆盖度和重现性更优。
**回收蛋白质组的理化性质表征：**GRAVY疏水性评分、理论分子量和理论等电点（pI）在DDM与TEAB工作流程间高度相似，Benjamini–Hochberg校正后所有比较均无显著差异（FDR校正P≥0.96），效应量均可忽略（Cliff's δ为?0.006至0.011）。实验2中，尽管直接TEAB的蛋白质组深度显著更高，但理化性质分布与TEAB+SP3高度可比（FDR校正P≥0.83，Cliff's δ为?0.007至0.011），表明省略SP3净化在增加深度的同时未改变回收蛋白质组的理化组成。
**跨工作流程的定量一致性：**两种实验中蛋白强度分布高度相似，表明各提取策略的动态范围和信号标度可比。变异系数（CV）分析显示各条件下技术变异性均较低；实验2中直接TEAB的技术变异性低于TEAB+SP3，表明样品处理策略影响定量重现性。
**回收蛋白质组的功能覆盖：**基因本体（GO）细胞组分富集分析显示，所有工作流程的亚细胞区室图谱高度相似，主要富集于核糖体、线粒体、囊泡和黏附相关组分，表明直接TEAB实现的更高蛋白质组深度未伴随细胞组分层面的明显偏倚。
**肾脏特异性蛋白质：**人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas）注释的14种肾小管特异性蛋白中，4种转运蛋白（SLC2A13、SLC2A12、SLC12A1和SLC12A3）在两项实验的所有TEAB基础工作流程中均被稳定鉴定，确认了显微切割的准确性及生物学完整性。
**重现性：**两项实验鉴定蛋白质重叠率为72.7%（5099种共有蛋白），相同条件下（27000 μm2 TEAB+SP3）跨实验比较的Pearson相关系数普遍高于0.6。两项实验的Q值和后验错误概率（PEP）分布相似，大部分鉴定结果处于低错误概率区间。
**样品间相似性：**主成分分析显示，实验1中各提取条件之间无明显分离；实验2中，直接TEAB与TEAB+SP3样品沿PC1形成清晰且不重叠的聚类，表明SP3净化的存在与否影响了整体蛋白质丰度图谱。
**与其他方法的比较：**与已发表的九项低投入量蛋白质组学研究相比，使用新鲜或新鲜冷冻组织的研究依赖专用仪器、更高投入量或自动化样品处理；而使用FFPE样品的研究通常需要更大投入面积、新鲜固定组织或自动化流程。研究人员的方法以27000 μm2的投入面积、纯手动操作，从存档超过10年的人类FFPE活检组织中达到4000–5500种蛋白质的鉴定深度，与资源密集度更高的工作流程相当。
**五、讨论与结论总结**
讨论部分指出，FFPE活检标本因蛋白质交联、起始材料稀缺及室温长期储存导致的蛋白质降解而面临提取挑战。研究人员从存档10至14年的肾活检组织中成功回收多达5500种蛋白质，表明TEAB提取在挑战性样本中的稳健性。实验1中DDM呈现预期的投入依赖性行为，而TEAB+SP3在两种投入量间无显著差异；实验2中直接TEAB显著优于TEAB+SP3（p=2.49×10??），提示磁珠结合与洗涤步骤可能导致极低投入量下的实质性样品损失。研究局限性包括：活检样本量和重复数有限、未能纳入TEAB+DDM或直接DDM（无SP3）对照、FFPE储存时间与组织保存的固有变异性、不同LC-MS/MS平台间未进行完全受控比较、手动操作可能引入处理相关变异、以及直接TEAB并非完全无净化（仍通过捕集柱或Evotips进行在线肽段净化）。研究人员强调，氧化和脱酰胺修饰因受FFPE处理影响显著而未予评估。结论指出，在所评估实验条件下，直接TEAB工作流程比DDM+SP3和TEAB+SP3实现更高的蛋白质组深度，从27000 μm2显微切割区域中回收多达5500种蛋白质展示了该方法在回顾性和资源有限的肾脏蛋白质组学研究中的潜力。该工作流程为利用临床样本库中广泛可及的存档FFPE样本开展回顾性蛋白质组学研究、探索罕见病、长期患者结局及历史队列提供了低成本、简单且实验室可及的技术框架，但在其他组织和临床背景中的适用性仍需进一步验证。
